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产品货号	产品规格
HB-circ-10	10 Tests
HB-circ-20	20 Tests

储存信息：-20°C 保存一年有效.

产品内容：


本试剂盒用到的引物如下（试剂盒没有配备，需要自行合成）：



恒圆生物pHB-circBasic^TM是一个5.5kb大小的环状 RNA (circRNA) 非病毒过表达载体。该载体可用来转染哺乳动物细胞，
可高效表达circRNA并促使其高效成环。该载体具有以下特点：
1)人巨细胞病毒的CMV启动子可以高效表达目的circRNA。
2)上下游成环元件Front cir-signal和Back cir-signal可以高效促使表达的circRNA环化。
3)线性化的载体非常方便目的circRNA直接无缝克隆，极大降低无关序列参与成环的几率。

实验流程
一、circRNA载体构建步骤：基于pHB-circBasic^TM的circRNA过表达构建采用无缝克隆策略。该策略促使成环的circRNA序列
和天然的circRNA一致，其做法是利用恒圆HB-infusion^TM 无缝克隆试剂盒，将目的circRNA序列拼接到线性化载体上即可
（如图2）。


克隆基本信息如下：
1）目的circRNA扩增。扩增引物如下：circ_F: cgtactaatgactttttttttatacttcag+circRNA特异性正向扩增引物 （18~25bp，
需要自己设计添加）
circ_R: cctaattcttttccttgcttcttac+circRNA特异性反向扩增引物（18~25bp，需要自己设计添加）

目的cirRNA扩增引物由两部分组成：引物5’端的下划线部分+目的cirRNA特异性扩增引物。其中下划线部分为无缝克隆所必
需，目的cirRNA特异性扩增引物和普通RT-PCR扩增引物设计类似。这对引物是以目的circRNA的cDNA或者人工合成DNA模板为
模板（推荐人工合成）进行PCR扩增。PCR程序如下：



产物需跑胶纯化、定量待用（操作细节请参考“HB-infusion^TM 无缝克隆试剂盒使用说明”）。
2）无缝克隆拼接circRNA和线性化pHB-circBasic^TM载体待HB-infusion^TM Master Mix充分融化混匀，按如下体系加入各反
应组分：



50℃孵育25 min，转化DH5a感受态。
3）重组子鉴定:克隆鉴定引物如下：
Construction ID_F: CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG
Construction ID_R: GTGTGAGCTACCGTGCCG
PCR程序如下：



空载体PCR产物大小~280 bp；重组子PCR大小约为280 bp+circRNA大小。
4）测序验证使用pcDNA3.1通用正反向测序引物对重组子进行测序鉴定。
T7_F：taatacgactcactataggg
BGH_R：tagaaggcacagtcgagg
5）转染成环验证通常转染到293T细胞验证能否成环。验证方法是设计circRNA对应的divergent primer进行RT-PCR并
测序。
6）转染目的细胞分析表型和功能。如果目的细胞转染效率较高则可以直接转染做功能分析。否则建议使用恒圆生物的
病毒载体系统circEnhanced^TM提高感染效率。

二、构建实例

我们以一个阳性circRNA (circPC)构建实例来说明这一载体具体使用方法：
1）已知circPC的序列如下：
GTTCATCATGCCTAGTGGCATATAAGAAGACCCCACCACCGGTCCCTCCACGAACCACATCGAAACCGTTCATCTCAG
TCACCGTCCAGAGCAGTACTGAGTCTGCTCAGGATACCTACCTGGACAGTCAAGACCACAAGAGCGAAGTGACGAGC
CAGTCGGGCTTGAGCAACTCATCAGACAGCCTGGACAGCAGTACCCGGCCACCCAGTGTGACACGGGGTGGAATTAC
CCCAGGCCCTGAAGCTCCGGAGCCACCCCCTAAGCATGCAGCTCTGAAGAGTGAACAAGGGACACTGACGAGCTCTG
AGTCCCATTCCGAGGCCATCCCCAAAAGGAAACTGTCATCGATAGGAATACAAGTTGACTGCATTCAGCCAGTGCCAA
AAGAGGAGCCCAGTCCCGCTACCAAATTCCAGTCCATCGGGATTCAGGTAGAGGACGACTGGCGAAGCAGTGCCCCCT
CTCACAGCATGTCCTCCCGTCGGGACACTGACTCTGATACCCAGGATGCCAACGACTCCAGTTGTAAGTCATCTGAGAG
GAGTCTCCCAGACTGTACCTCACACCCCAATTCCATCAGCATTGATGCTGGCCCCCGACAGGCCCCCAAGATTGCCCAG
ATCAAGCGCAACCTCTCCTATGGAGACAACAGCGACCCTGCCCTGGAGGCGTCTTCGCTGCCCCCACCCGACCCTTGGC
TGGAGACTTCCTCCAGCTCCCCAGCAGAGCCCGCTCAGCCAGGGGCCTGCCGCAGGGATGGCTACTGGTTCCTGAAGC
TCCTTCAGGCAGAAACGGAGAGACTGGAAGGCTGGTGCTGCCAGATGGACAAGGAGACCAAAGAGAACAACCTCTCTG
AAGAAG
注：circRNA序列可以通过ID或者序列从circBase调取，教程可以联系恒圆技术工程师索取。
2）circPC的扩增：
a. circPC扩增引物：circPC_F: （61bp,TM=60°C）cgtactaatgactttttttttatacttcagGTTCATCATGCCTAGTG
GCATATAAGAAGAC
circPC_R: （53bp,TM=60°C）
cctaattcttttccttgcttcttacCTTCTTCAGAGAGGTTGTTCTCTTTGGT
b. circPC扩增程序：


c. 无缝克隆拼接circPC和线性化pHB-circBasic载体，体系如下：



50℃孵育25 min，转化DH5a感受态。
d. 重组子菌落PCR鉴定:克隆鉴定引物如下：
Construction ID_F: CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG
Construction ID_R: GTGTGAGCTACCGTGCCG
PCR程序如下：



1%琼脂糖凝胶电泳确定阳性：空载体PCR产物大小~280 bp；阳性重组子PCR大小约为1.1 kb。
e. 阳性重组子测序使用pcDNA3.1通用正反向测序引物对重组子进行测序鉴定：
T7_F：taatacgactcactataggg
BGH_R：tagaaggcacagtcgagg
f. 转染293T细胞，确认成环。如果转染效率足够，也可以在目的细胞内验证成环。利用
divergent primer通过RT-PCR来鉴定过表达circRNA是否成环，其引物信息如下：
circPC_ID_F: CTCACAGCATGTCCTCCCG
circPC_ID_R: GTCCAGGCTGTCTGATGAG
产物大小：590 bp.
PCR体系如下：



PCR 程序如下：



g. 如果条带大小符合预期则通过测序确认接头序列，测序引物：circPC_ID_F: CTCACAGCATGTCCTCCCG.
结果峰图如下,发现circPC首尾相连证明成功成环