酵母双杂交

一. 酵母双杂交：
酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system，Y2H）基于真核生物转录调控系统，即真核转录激活因子的组件式结构。转录因子通常有两个可分割的、功能相互独立的结构域BD(DNA-binding domain)和AD (activation domain)组成。BD结合靶基因上游的操纵子序列，AD聚集RNA聚合酶II复合物，共同作用启动转录。这两个结构域分开时各具有功能但不能激活转录，只有两者在空间上较为接近时，才能呈现完整的转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的启动子，使下游靶基因得到转录。
Y2H应用：
检测并验证两个已知蛋白质间的相互作用；
筛选兴趣蛋白与新的蛋白质间相互作用（即cDNA文库筛选）。
酵母双杂交系统：
A. 核蛋白系统
1. Clontech GAL4-based two-hybrid system：
载体：pGADT7，pGBKT7；酵母菌株：AH109。
2. Invitrogen ProQuest™ Two-Hybrid System：
载体：pDEST32，pDEST22；酵母菌株：Ma V203。
适用于目的蛋白为胞质蛋白及核蛋白。
B. 膜蛋白系统
1. Split ubiqutin system (mbSUS)：
载体：pNXgate32-3HA，pXNgate21-3HA，pMetYCgate；酵母菌株：THY.AP4。
2. DUALmembrane system (MbY2H)：
载体：pBT3-N，pBT3-STE，pBT3-SUC，pDHB1，pPR3-N和pPR3-C。
酵母菌株：NMY51 yeast strain。
适用于目的蛋白为膜蛋白及膜蛋白与胞质蛋白。
服务内容：
1. 构建包含目的蛋白的质粒；
2. 重组质粒转化至酵母细胞；
3. 阳性互作克隆菌株的筛选。
实验周期与价格：

项目名称	项目说明	单价	周期
载体构建	1500bp以下	800-1000元/载体（核/膜蛋白）	1-2周
	1500-2500bp	1800-2000元/载体（核/膜蛋白）
	2500-3500bp	3000-3500元/载体（核/膜蛋白）	2-3周
双杂交试验	载体转化酵母	500/反应	4周
	自激活3-AT浓度筛选	500/样本
	确定蛋白互作结果	500/组（1实验组+3对照组）

提交的产品和资料：
实验流程、电泳图结果、分析结果等。

二. 酵母双杂交文库构建及筛选
自1989年Field等人建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白相互作用的系统以来，酵母双杂交系统已经越来越多的应用于鉴定新的蛋白与蛋白相互作用，蛋白级联底物以及突变对蛋白与蛋白结合的影响等。文献统计表明，目前已知的蛋白质相互作用至少有一半是通过酵母双杂交实验发现的。而文库筛选结果直接由文库质量的好坏所决定，构建出高质量的文库是得到好的筛选结果的关键因素。
康颜生物拥有多年的文库构建经验，所采用的技术以及试剂盒均为市场上质量最好的文库构建试剂，保证所构建的每一个文库各项指标均为市场上最高标准，文库构建的成功率达到98%以上。
产品质量标准：
1. 原始文库库容量大于1×10⁷CFU；
2. 平均插入片段大于1200 bp ；
3. 克隆阳性率大于95%。
技术特点与优势：
1. 采用同源重组的方法构建文库，不经过任何的内切酶切割和连接过程，确保不会出现基因被酶切切断的情况，能够保证基因的完整性以及文库构建的高效率。
2. 使用多种酶在16℃恒温的条件下直接合成cDNA第二链，完全忠于样本自身的基因情况，不会人为的改变样本内的基因情况及基因大小，保证文库的质量。（如用PCR的方法合成cDNA第二链，由于PCR的选择性抑制及竞争性扩增，会造成基因冗余度非常高，低丰度及长片段的基因PCR扩增不到而丢失，且产生非常多的重复序列，特别是起始的RNA样本量少的情况，如5 μg RNA以下就需要进行15个循环以上的PCR扩增，大大降低文库质量及文库包含的基因数量)。
3. 采用高质量的反转录酶，该酶具有更高的反转录温度（55℃反转，较高的温度可以打开RNA的二级结构，可以获得更长的cDNA），使得反转录效率和cDNA长度更好，文库的平均插入片段在1.2Kb以上。
4. 赠送3个读码框的处理，确保插入基因不受蛋白移码的影响而正确表达。
交付结果：
酵母双杂交文库可选择使用pGADT7（Clonetech，推荐）和pDEST22（invitrogen）载体，交付的产品如下：

产品名称	交付标准	包装形式	储存条件
酵母双杂交文库甘油菌	库容：大于1×107CFU 平均插入片段：大于1200 bp 阳性率：大于95%	1.5 mL螺旋管	-80℃
酵母双杂交文库质粒	大于200 μg	1.5 mL螺旋管	-80℃
文库构建报告	电子版	Word和PDF	常温
文库构建图片	电子版	JPG格式	常温
转化到酵母细胞的文库甘油菌（可选）	100 mL库容>1×108CFU / mL	离心管	-80℃

服务周期与价格：

项目名称	价格（元）	周期
酵母双杂交文库构建	27000	25工作日，如需转化酵母延长15个工作日。
均一化处理	3000
酵母转化	4000	15工作日

备注：酵母文库可以选择增加均一化处理步骤，使用DSN法均一化方法，构建出的均一化酵母杂交文库，可减少后续酵母筛选的工作量和筛选效率等。
材料要求：
客户构建指定的酵母双杂交cDNA文库，由客户提供组织、细胞或总RNA：
细胞样本：细胞数量大于1×10⁷ ； 
组织样本：大于2 g ；
总RNA：大于200 μg 。
文库筛选服务时间及价格：

项目名称	项目说明	价格	周期
载体构建	1500bp以下	800元/载体	1-2周
	1500-2500bp	1800元/载体
	2500-3500 bp	3000元/载体	2-3周
酵母转化费用	质粒转化酵母	500元/反应	1周
自激活检测	排除假阳性	500元/组	1周
酵母文库筛选	钓取互作蛋白	7000元/次	2-3周
筛选结果测序	互作蛋白序列获取	300元/克隆	1周
回转验证	确认互作结果	500元/克隆	1周