蛋白质分析
蛋白质是指主要由α-氨基酸组成的一类高分子化合物,其数目数以千计。有时需要对蛋白质的总量进行测定,但有时又需要确定蛋白质混合物中的一种,因而测定其总量的方法便不适用。所以,蛋白质测定方法或者是针对所有蛋白质的,或者是针对其中个别蛋白质的。特异性的方法或者是依赖于分析样品的制备步骤,或者是依赖于待测蛋白质的某些特殊的性质。
对于具有生物功能的蛋白质的定量(如激素),由于蛋白质变性的存在、总量的测定有时并不能真正地反映其生物活性。对这类蛋白质的定量可选择化学定量法或生物分析法。对于酶,通常是测定其活性,而不是测定其蛋白质的含量。
在蛋白质分析化学中,除了定量分析之外,还有许多分析问题涉及蛋白质的构型或不同层次的结构研究,蛋白质氨基酸序列的测定等。
由于蛋白质种类繁多、结构复杂、生物活性各异,一种蛋白质并非单一基因所表达的产物,并且同一蛋白质还存在多种翻译后的修饰,蛋白质分析正处于发展阶段。
蛋白质分析必须满足以下基本要求:
(1)高效提取并分离所有蛋白质组分,
(2)准确鉴别和定量分析每一组分,
(3)能比较分析表达图谱的复杂变化,其中蛋白质所有组分的完全分离是蛋白质组研究的前提。
蛋白质分析的意义
1、基础科学研究
这主要是生命科学研究向分析学家提出的课题。在生命科学研究中,人们需要了解各种蛋白质的组成、结构与功能的关系,蛋白质的存在形态及与小分子,甚至金属离子的相互作用等等。而对分析化学家来说,蛋白质分析是一个难题,因为蛋白质分子量大(分子量一般为6000-1000000),结构复杂(有四级结构)和种类繁多(约有1010-1012种)等特点。这些持点决定了蛋白质分析与小分子为对象的分析区别甚大。因此,分析化学家要不断地针对蛋白质的特点去发展新的理论,创造新的实验手段和分析方法。
2、食品的鉴定与评价
蛋白质是生物体的重要营养物质,也是食品的重要营养指标。人及动物只能从食品中得到蛋白质及其分解产物来合成自身的蛋白质。蛋白质可以被酶、酸或碱水解,水解的最终产物是氨基酸。氨基酸可以进入蛋白质的代谢库重新被利用。氨基酸是构成蛋白质的基本物质。在构成蛋白质的氨基酸中,亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸及缬氨酸这8种称为必需氨基酸,它们在人体中不能合成,必须依靠食物供给,它们对人体有着非常重要的作用。各种食品中的蛋白质含量差异甚大。如牛肉中蛋白质的含量为20%左右,猪肉为9.5 % ,牛乳为3.5 % ,大豆为48 % ,大米为8.5 % ,菠菜为2.4 % ,黄瓜为1.0 % ,桃为0.8 % ,苹果为0.4 % 。因此,测定食品中蛋白质的含量对指导食品的加工工艺的改革、优化保健食品的配方以及合理配膳均有重要意义。
3、评价健康状况、诊断疾病
人体内的酸碱平衡,电解质平衡,遗传信息的传递,物质的代谢和运转都与蛋白质有关。蛋白质不仅是血浆的主要成分,而且也分布于各种细胞的外液,关节滑液,脑脊液等等。
血浆蛋白质的成分复杂,多达三百余种,许多种蛋白质的含量随疾病的不同有所增减,在临床诊断上具有重要意义。
总蛋白升高,可考虑各种失水导致血液浓缩的疾病,多发性骨髓瘤,巨球蛋白血症等等。
血清总蛋白降低,可能是体内水分过多,多渠道血清蛋白丢失,如肾病综合症,营养不良,蛋白质合成障碍等。
球蛋白升高:多见于多发性骨髓瘤及某些淋巴瘤、肝硬化、血吸虫病、疟疾等等。
球蛋白降低:可考虑低丙球蛋白血症和肾上腺皮质功能亢进等。
蛋白质定量分析方法
在生物研究、以及医药和食品等行业和临床诊断领域中,蛋白质的定量分析是常检项目和重要指标。
1、蛋白质的测定方法很多,常用的方法可以分为三大类:
一是基于蛋白质与一些物质的化学反应所建立的化学法;
二是根据蛋白质的生化性质所建立的生物检定法和免疫法;
三是依据蛋白质与不同试剂的反应和仪器测试技术所建立的仪器法。
化学法操作较为简单,常用于微量蛋白质日常的快速分析;后两者通常配合高灵敏度的精密仪器,一般用于痕量或超痕量蛋白质的分析。
2、蛋白质分析方法可分为两大类,
一类是利用蛋白质的共性,如含氮,含肽键和折射率等性质测量蛋白质的含量;
二是利用蛋白质中某些特定的氨基酸残基、芳香基团、酸性和碱性基团等测量蛋白质的含量。迄今,测定蛋白质的分析方法有多种多样,如克氏定氮法,金属络合物,染料做探针的各种分光光度法,荧光染料做探针的荧光分析法,化学发光分析法,气相色谱分析法,液相色谱法.甚至发展了全自动的氨基酸分析仪。
蛋白质结构与构象分析方法
蛋白质成分通过各种分离技术分离后,须通过适当手段进行结构和功能以及各蛋白质间的相互作用关系的研究,从而最终实现蛋白质组表达模式和功能模式的研究。
研究蛋白质结构和构象的方法很多,总体上可概括为两大类:
一类是测定溶液中的蛋白质分子构象。如核磁共振法,圆二色谱法,激光拉曼光谱法,荧光光谱法,紫外光谱法,氢同位素交换法。
另一类是测定蛋白质分子的晶体结构。如X-射线衍射分析法和小角中子衍射法。
X-射线衍射分析法虽然可以较准确地测量晶态蛋白质分子的空间结构,但许多蛋白质并不能培养出单晶;并且生命体中的蛋白质多数以溶液状态存在,与晶体中的结构往往有一定的差别。中子衍射法由于仪器昂贵等原因,目前应用于蛋白质分子的构象研究才刚起步。