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PCR法DNA探针标记试剂盒

价格：￥1

品牌：xuanya

产地：中国/美国

最新更新日期：2021-08-06 17:34

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上海烜雅生物科技有限公司

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产品属性

保存条件

常温运输和保存

保质期

两年

英文名	PCR DNA Probe Labeling Kit

数量

890

供应商	上海烜雅生物科技有限公司

规格

5次

产品说明

PCR法DNA探针标记试剂盒原理及特点：
PCR标记的原理是用带标记的dNTP进行PCR，最后得到的PCR产物将带有标记，可以直接用于杂交试验。本产品就是基于上述原理的基础上开发，它具有下列特点：
1.一站式，本试剂盒提供经过优化的试剂，不需要用户自己摸索。
2.足够10次50uL体系的常规PCR（用于制备标记反应的模板和设置对照反应）和5次50uL体系的标记反应。
3.一次标记可以得到ug级的双链DNA探针或约700ng的单链DNA探针，足够多次杂交实验用。
4.既可用于制备双链探针，也可以用于单链探针。
5.A型需自备含标记核苷酸的dNTP，B和C型分别含生物素和Digoxin标记的底物。可用的自备标记底物包括fluorescein-dUTP、hydroxycoumarin-dUTP、resorufin-dUTP和aminoallyl-dUTP等。
6.掺入率一般为4-5%，有效降低了空间阻碍，检测效果最佳。
7.标记探针可以用于Southern和NorthernBlot、原位杂交、菌落和斑点印迹杂交等分析。
8.本产品足够5次非标记PCR和5次标记PCR（均指50uL体系）。

PCR法DNA探针标记试剂盒运输及保存：
低温运输，-20℃保存，有效期一年。
自备试剂：DNA模板和模板专一性引物。

PCR法DNA探针标记试剂盒使用方法
一：准备工作
1.按常规的方法设计PCR引物，使探针长度在400-800bp之间。过短则标记参入少，探针杂交信号强度减弱；过长则非特异杂交增加，背景变强。
2.由于标记的dNTP比较珍贵，所以不推荐以基因组DNA或其他复杂DNA为模板直接进行PCR标记，而是建议采取下述的两步法标记来提高成功率，即先制备非标记PCR产物，再以之为模板制备标记的PCR产物。
3.对A型标记试剂盒，四种10mM的dNTP是分开提供，用于制备50uL非标记dNTP（2mMeach，用于非标记PCR，用于制备标记PCR的模板。配制方法是四种10mM的dNTP各加10uL，再加水10uL即可）和25uL标记dNTP（2mMeach，其中标记核苷酸和对应的非标记核苷酸的比例需要自行优化，假如是biotin或DIG标记的是dUTP，则其对应的非标记核苷酸是dTTP，两者的最佳比例一般为1：3；如果是BrdUTP，则两者的最佳比例为1：1。配制方法是三种10mM的dNTP各加5uL，再加标记核苷酸和其对应的标记核苷酸使其总的终浓度为2mM，再补水到25uL）。

PCR法DNA探针标记试剂盒二：非标记PCR产物的制备
4.设置50uL非标记PCR：2×标记专用PCRMix25uL，dNTPMix（2mMeach）5uL，自备的探针引物（10pmol/uL）各1uL，1ug基因组DNA或1ng质粒DNA，补超纯水到50uL。
5.按已经优化的PCR参数进行常规PCR。
6.胶回PCR产物并定量，胶回收可以避免残留引物干扰后续的标记PCR。

三：标记PCR反应（最好做一个不加标记的对照用于定量）
注意：由于双链PCR探针在杂交时变性的双链彼此还会复性，降低杂交效率，因此强烈推荐使用单链标记PCR。

PCR法DNA探针标记试剂盒注意：本试剂盒提供的dNTP混合物总浓度为2mM，所含标记dUTP与非标记dTTP的比例已经进过优化。
7.按第5步的PCR参数进行标记PCR，但需要进行下列修改：一是循环数增加到35-55个循环。由于模板为纯化后的PCR产物，探针对扩增长度完整性要求不高（长度不均的探针由于能形成网络结构，效果反而更好），所以可以增加循环数；二是延伸时间增加15秒，因为标记dUTP参入到DNA的速度比常规的dTTP慢；三是降低复性温度5-7℃，因为标记核苷酸参入到DNA后，新模板的Tm值将降低。
8.标记探针的定量：取标记反应液和对照反应液1-5uL，在琼脂糖凝胶上跟浓度已知的DNAmarker一起电泳，并判断探针的浓度。由于标记产物中额外带有生物素，Digoxin等、其泳动速度将慢于非标记PCR产物（但同位素标记不能用此法）。下图是一个典型的双链PCR产物电泳结果图：

注意：如果扩增的是单链DNA探针，其结合EB的能力远低于双链DNA，因此EB染色的强弱不能准确反应DNA的真实浓度，可以采用银染定量（跟marker比较）。一般100ng模板经单链PCR扩增可得到700ng左右探针。
9.剩余的PCR标记产物可以不经过纯化，直接加入（对单链PCR探针）杂或加热变性并急冷后加入（对双链PCR探针）到杂交液中使用。也可放-20℃长期保存。如果需要纯化，请使用乙酸铵/乙醇沉淀法纯化。

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