EMSA凝胶迁移技术服务

EMSA凝胶迁移技术服务原理EMSA凝胶迁移技术服务是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。

EMSA凝胶迁移技术服务实验步骤：
1. 探针的标记;
2. 探针的纯化;
3. EMSA胶的配制;
4. EMSA结合反应;
5. 电泳分析。
EMSA凝胶迁移技术服务客户需知： 方法：同位素32P标记探针/生物素/荧光素标记/进行检测。 技术要点：实验过程包括核蛋白的提取，同位素标记/生物素/荧光素标记/与纯化，凝胶电泳，胶片暴光等。在EMSA操作中会用到同位素，要注意实验室环境和实验员的保护。


EMSA凝胶迁移技术服务实验细节：
1、探针用量: 这相当于10-50fmoles的DNA探针。我们通常是最少50fmol.
2、蛋白样品用量: 一般用量在2---20ug(控制在1-5µl)蛋白, 总体系15ul. 细胞核抽屉物浓度都比较低,组织的一般都比较高,因为杂蛋白较多.
3、poly(dI:dC)(dI:dC): 它由肌苷和胞嘧啶组成。由于其特定的结构，可抑制蛋白对标记探针的非特异结合，避免假复合物。 在凝胶迁移反应中加入poly(dI:dC)(dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中其它DNA结合蛋白结合，比如转录调节因子的非特异结合。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时，不必一定加入poly(dI:dC)(dI:dC)，如加入，则普通反应中所用终浓度不超过50-100ng。对核抽提液:每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)(dI:dC)。
未标记的竞争性寡核: 做为竞争的探真来说,其实就是没有标记的转炉银子的寡核苷酸,用量一般是正常探真的50-100倍.在这里我引申的解释一下其他的对照的含义:
◆. 常规反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针)；
◆ 阴性对照反应(核蛋白＋标记探针);
◆ 阳性对照(核蛋白＋标记探针)
◆ 探针冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针＋标记探针100倍量的未标记探针)；
◆ 突变探针的冷竞争反应(含激活的目的转录因子的 核蛋白＋标记探针＋标记探针100倍量的未标记突变探针)；
◆ Super-shift反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针＋目的转录因子的特异抗体).
4. 预电泳和电泳：0.25X TBE在冰上120V 预电泳1小时; 务必换掉预电泳的缓冲液, 用新的0.25X TB低温下150V，电泳约60分钟。 注意横压电泳的时候注意电流的数字变化,记录开始电泳和电泳结束的电流数据的变化!
5. 电转运
在0.5X TBE中390mA电转移40分钟, 注意转运膜的选择, 有一种离子加强型的转运效果比较好! 我当初选择过一般的和离子加强型的,还是离子加强型结合效果好!
6.紫外交联: 正规的应该是紫外交联仪的使用,但是很多单位没有交联仪,那就用无菌操作台上的紫外等下10cm处交联10分钟就可以了!这个数据是我做了好多次试验才摸索出来的!
条件比较成熟!可以借鉴!
7. 化学发光反应
包括Blocking Buffer 30分钟封闭, Streptavidin-HRP标记, Washing Buffer洗涤; Equilibration Solution平衡, 这些按照规定操作即可! 没有太多的细节,只是注意两点,一是期间结合膜的表面一定不能干燥!!!二是Streptavidin-HRP不能加在膜上,而是加在液体中混韵后在将膜放在液体中孵浴.


EMSA凝胶迁移技术服务客户提供： 细胞 25ml的细胞瓶培养的细胞。 组织 200mg-400mg 探针 自备探针。
结果交付：实验步骤、结果报告、图片


一EMSA凝胶迁移技术服务核蛋白抽提 探针标记 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 免疫印迹电转移 检测获得图像相关
二 非放射性EMSA实验
1. 非放射性EMSA实验原理非放射性EMSA实验原理基于化学发光检测系统与EMSA相结合，利用生物素标记的探针与HRP标记的亲和素之间的结合，通过增强化的化学发光底物可以发出荧光的方法，可用仪器检测出DNA－蛋白质互作产生的电泳迁移率的变化。
2.　Viagene 非放射性EMSA简介 Viagene EMSA成套试剂是结合高灵敏度的化学致发光技术建立起来的实验系统。特异性检测活化的NF-KB，STAT3，STAT5等。
非放射性EMSA特点
针对性强：针对活化的NFKB，STAT3, STAT5等。
成功率：实验条件成熟，成功率高，无需再摸索实验条件。
即用性：实验用品已经配备好，拿来即用。 操作简单, 价格便宜：性价比高
本公司只提供非放射性EMSA凝胶迁移技术服务
EMSA的典型分析结果可以参见下图说明
1,阴性对照反应(标记探针)；
2, 常规反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针)；
3, 探针冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针＋标记探针100倍量的未标记探针)；
4, 突变探针的冷竞争反应(含激活的目的转录因子的 核蛋白＋标记探针＋标记探针100倍量的未标记突变探针)；
5, Super-shift反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针＋目的转录因子的特异抗体)。


上海釜诚生物科技有限公司
上海市东高路680号柠檬公寓A120室
联系电话：18317038349 刘振
QQ：2441149844
邮箱：bio_fcen@163.com