糜蛋白酶（Chymotrypsin）试剂盒说明书分光光度法 50T/48S
注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
糜蛋白酶，又称胰凝乳蛋白酶，是胰腺分泌的一种蛋白水解酶，能迅速分解变性蛋白质。糜蛋白酶的功能与胰蛋白酶相似，但是具有分解能力强、毒性低和不良反应小等优点。临床上糜蛋白酶用于痰液稀化，对脓性和非脓性痰液均有效；也用于创伤或手术后伤口愈合，如白内障摘除。
测定原理：
糜蛋白酶催化N-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA 水解，产物在 410nm 有特征光吸收；通过测定 410 nm 光吸收增加速率，来计算糜蛋白酶活性。
自备仪器和用品：
台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、分光光度计、1mL 玻璃比色皿、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制：
提取液：液体 60mL×1 瓶，4℃保存。试剂一：液体 60mL×1 瓶，4℃保存。试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。粗酶液提取：
组织样品：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液）冰浴匀浆，8000g，4℃离心 10min，取上清，即粗酶液。
测定步骤：
- 分光光度计预热 30min，调节波长到 410 nm，蒸馏水调零。
- 试剂二的配制：临用前加入 50 mL 试剂一充分溶解，置于 37℃水浴中预热 5min，用不完的试剂 4℃保存一周。
3．1mL 玻璃比色皿中加入 100μL 粗酶液，900μL 试剂二，立即混匀并在 37℃下测定 410nm
处 3min 时吸光值 A1 与 8min 时吸光值 A2，记为△A=A2-A1。
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糜蛋白酶活性计算公式：
- 按蛋白浓度计算
活性单位定义：37℃每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol 4-硝基ben胺为一个酶活单位。糜蛋白酶（U/mg prot）=△A ×V 反总÷（ε×d）÷(Cpr×V 样)÷T×109
=227×△A÷Cpr
- 按样本质量计算
活性单位定义：37℃每克样品每分钟催化产生 1nmol 4-硝基ben胺为一个酶活单位。糜蛋白酶（U/g 鲜重）=△A ×V 反总÷（ε×d）÷(W×V 样÷V 样总)÷T×109
=227×△A÷W
V 样：加入反应体系中粗酶液体积，0.1mL；V 样总：粗酶液总体积，1 mL；V 反总：反应总体积，1mL；ε：4-硝基ben胺摩尔消光系数，8800 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm； T： 反应时间，5min； W：样品质量，g；Cpr：粗酶液蛋白质浓度，mg/mL。
