伪狂犬病毒检测试剂盒说明书20151201版
（Taqman探针一步法实时荧光RT-PCR）
编号：KA006.01YB
规格：48头份介绍：伪狂犬病（Pseudorabies,PR）(又名奥耶斯基氏病，Aujeszky’s disease)是由伪狂犬病毒（PRV）引起的家畜和多种野生动物共患的传染病。临床上以发热、奇痒（猪除外）和脑脊髓炎为主要特征。猪感染后主要表现为母猪的繁殖障碍和仔猪的高病死率。世界卫生组织（OIE）将其列为必须通报疾病。我国2008年修订的《一、二、三类动物疫病病种明录》将其列为二类动物疫病。用途：该试剂盒用于对PRV进行检测，有助于对PRV的实验室诊断、监测和流行病调查。原理：本试剂盒采用一步法实时荧光反转录聚合酶链式反应(One-Step Real Time RT-PCR) ，结合Taqman技术，对特异核酸进行定性或定量检测。试剂盒的组成| 试剂名称 | 数量 |
| PRV反应液 | 550μL×1管 |
| PRV引物探针 | 100μL×1管 |
| 无核酸水 | 1000μL×1管 |
| PRV阴性对照 | 1000μL×1管 |
| PRV阳性对照 | 150μL×1管 |
保存期及贮藏条件：本产品-20℃避光可保存12个月。样品收集，操作和储存1. 最好选择发病早期，无菌采样并立即送往实验室进行病毒检测。2. 样品短期可在4℃冷藏保存，较长时间保存应在--20℃或者-70℃，并且避免反复冻融。检测步骤1.核酸提取样品进行适当处理后，可采用本公司的核酸提取试剂盒，该试剂盒可用于对样本中病毒RNA的提取，请按照提取试剂盒说明书进行操作。也可选择其他合适的商品化产品。2.扩增试剂的准备将样品数+1份阴性对照+1份阳性对照设为N，计算试剂所需量，反应体系配制见下表| 试剂名称 | N份用量（20μL体系） |
| PRV反应液 | 10μL×（N+1） |
| PRV引物探针 | 1.8μL×（N+1） |
| 无核酸水 | 6.2μL×（N+1） |
将各试剂按照表中用量加入无菌离心管中，充分混匀，短暂离心后在PCR反应管中分别加入18μL混合液。3.加样将制备好的样本，阴性对照，阳性对照各取2μL分别加入对应反应管中，加完后盖紧PCR反应管盖，置于PCR仪上。4.荧光PCR扩增与信号收集| 循环数 | 温度（℃） | 时间 | 数据收集位点 |
| 1 | 95 | 2min | - |
| 40 | 95 | 15s | - |
| 60 | 1min | 数据收集 |
注：报告基团选FAM,淬灭基团选NONE。结果成立原则阳性对照：CT值＜30并有明显的扩增曲线。阴性对照：无CT值或者CT值>37，线性为直线或者轻微斜线，无明显扩增曲线。以上要求需同时满足，否则本次实验无效，需要重新进行。结果判定| CT值 | 样本检测结果 |
| <30并有明显的扩增曲线 | 阳性，样本中检测出PRV。 |
| 30-37 | 可疑，需重复检测。若第二次检测CT值仍为30-37并有明显扩增曲线则判定为阳性，否则为阴性。 |
| >37并无扩增曲线 | 阴性，样本中未检测出PRV。 |
注意事项1.反应体系应在特定配液区或者超净工作台中配制，整个实验过程严格控制污染。2.PCR整个试验分配液区、模板提取区、扩增区。流程顺序为配液区→模板提取区→扩增区。严禁器材和试剂倒流。3.使用不含荧光物质的一次性手套，一次性离心管。4.反复冻融试剂将减低检测灵敏度，本试剂盒应在5次内用完.5．-20℃保存的各试剂管使用前应在室温下完全融化，液体融化后需彻底混匀，2000 rpm离心15 s ，使用后立即放回-20 ℃。6．在RNA提取过程中，避免RNA酶污染，尽量缩短操作时间。7．注意防止试剂盒组分受污染。不要使用超过有效期限的试剂，试剂盒之间的成分不要混用。8.PCR反应管避免气泡存在，管盖需盖紧。9.不同批次的试剂盒勿混用。
