禽流感病毒H7亚型单重荧光PCR检测试剂盒
一、简介
H7亚型禽流感病毒已经发现感染人、家禽和候鸟， H7亚型实时荧光qRT-PCR检测试剂是按照国际检测标准而制备的商业化检测试剂盒。本试剂盒可在一个反应中同时检测H7型流感病毒，其中H7亚型流感病毒的探针报告基团为FAM。
二、用途
本试剂盒适用于检测各种咽拭子、鼻拭子、泄殖腔拭子、组织样品等临床样品中H7亚型流感病毒。适用于H7亚型流感病毒感染的辅助诊断、监测及流行病学调查，其检测结果仅供参考。
三、试剂盒组成（48T/Kit）
| 组成成份 | 数量 | 规格 |
| 荧光qRT-PCR反应液（H7-qRT-PCR MIX） | 1管 | 672μL/管 |
| 酶混合物(Enzymes MIX) | 1管 | 48μL/管 |
| 无核酸酶水（Nuclease-Free Water） | 1管 | 500μL/管 |
| 阴性对照 (NTC) | 1 管 | 50μL/管 |
| 阳性对照 （H7-PTC） | 1 管 | 50μL/管 |
四、储存条件及有效期
本试剂盒于-18℃以下保存，有效期为6个月。
五、荧光PCR仪器适用范围
ABI系列，Roche系列等荧光定量PCR检测仪等。
六、样品的采集与RNA提取
6.1 样品的采集
按照相关标准采集。标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃。但不能超过6个月，标本运送应采用0℃冰壶。
6.2 样品RNA提取
可按常规方法提取，也可采用商品化试剂盒提取病毒RNA。
- 取灭菌的1.5 mL Eppendorf离心管，做好标识。
- 每管加入600 µL裂解液，分别加入被检样本各200 µL，再加入200 µL氯仿，混匀器上振荡混匀5 s，于4℃ 12000 g 离心15 min。
- 取无RNA酶的1.5 mL Eppendorf离心管，加入-20℃预冷400µL异丙醇，吸取步骤（2）各管中的上清液转移至相应的管中，避免吸出中间层，颠倒混匀。
- 于4℃ 12000 r离心15 min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；加入600µL 75％预冷乙醇，洗涤。
- 于4℃ 12000 r离心10 min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体。室温干燥5 min～10 min。
- 加入10µL 无核酸降解酶的水，溶解管底的RNA，5000 r离心5 s，冰上保存备用。若需长期保存须放置-70℃ 冰箱。
注：阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸（无需提取），直接取5µL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议最后在样品制备区域加入阳性对照。
7.1 试剂的准备
从试剂盒中取出荧光qRT-PCR反应液（H7-qRT-PCR MIX）、酶混合物（Enzymes MIX），冰上融化并振荡混匀后，10,000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N（N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照），每个测试反应体系配制如下表：
| 试剂 | 每个反应加入的量 | N个反应加入的量 |
| 荧光PCR反应液 | 14µL | N ×14µL |
| 酶混合物 | 1 µL | N × 1 µL |
| 总量（Total Volume ） | 15 µL | N ×15µL |
计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10,000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL，向每管中加入处理后样品或阴性对照（NTC）和阳性对照（H7-PTC）5μL，10,000rpm瞬时离心10秒。
7.2 real time RT-PCR反应条件
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件:
| 反转录（Reverse Transcription） | HOLD | 45°C for 10min |
| 预变性 | 1循环 | 95°C for10min |
| PCR 扩增（PCR amplification ） | 40 循环 | 95°C for 15 sec
60°C for 45 sec |
在60°C 延伸时收集荧光信号 报告基团：设置为FAM。
8.1 结果分析条件设定
直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
8.2 试验成立判定
（1） 阴性对照（NTC）：不应产生任何的扩增曲线。
（2） 阳性对照（H7-PTC）：均产生扩增曲线。
8.3 结果判定
（1） 在试验成立的条件下，Ct值≤35的样本为阳性，表明H7核酸阳性。
（2） Ct值显示为无的样本为阴性样本，表明H7核酸阴性。
（3） 如果35＜Ct值≤40，判为可疑样品。对于可疑样品，先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线，则为可疑阳性，否则判为阴性。
（4） 对于可疑阳性样品，重新抽提核酸，再次进行H7 qRT-PCR检测。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为样本阳性，表明H7核酸阳性；否则判为样本阴性。
九、注意事项
- 初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。
- 所有使用的离心管最好高压灭菌，而且必须不含RNA酶。
- PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等)，防止实验室污染。
- 样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行，以免污染。
- 试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
