质粒大量抽提试剂盒

质粒大量抽提试剂盒是一种用于从大肠杆菌中进行大量质粒的快速抽提的试剂盒。

本试剂盒采用了一种新型的离子交换柱。在特定条件下，使质粒能在离心过柱的瞬间，结合到质粒纯化柱上，在一定条件下又能将质粒充分洗脱，从而实现质粒的快速纯化。无需酚氯*(代"仿")抽提，无需酒精沉淀，6个样品只需不足90分钟即可完成。

两步过柱纯化，使质粒纯度进一步提高，达到转细胞级要求。

每个质粒纯化柱可以结合的质粒量的上限大于500微克。每个纯化柱可用于抽提100毫升左右用LB培养过夜的大肠杆菌。抽提所得质粒的OD值一般在1.80左右。抽提获得的质粒量会受质粒拷贝数等因素影响。抽提获得的质粒DNA的OD值也会因菌种不同等原因而略有波动。

由本试剂盒所得质粒可直接用于转染细胞，DNA测序，PCR，基于PCR的突变，体外转录，转化细菌，内切酶消化等。本试剂盒抽提的含Fireflyluciferase或Renilaluciferase报告基因的质粒，用Lipofectmine2000或Fugene6转细胞，报告基因检测结果表明仅0.5微克受SV40启动子控制的质粒转化12孔板内的一孔原代贴壁细胞，总RLU值约为五百万，测定时间为10秒。

内毒素(endotoxin)含量低。用对内毒素敏感的细胞转染受内毒素响应的报告基因质粒，与Qiagen昂贵的EndotoxinFree大抽试剂盒相比，检测结果完全一致。

保存条件：

室温保存，一年有效。

注意事项：

第一次使用前把试剂盒提供的RNaseA全部加到溶液I(悬浮液)中，混匀，并在瓶上做好标记。加入RNaseA后4℃存放。

第一次使用前在每瓶溶液IV(洗涤液)中加入54ml无水乙醇，混匀，并在瓶上做好标记。

温度较低时，溶液II和溶液III可能会有沉淀产生。使用前必须检查一遍。如有沉淀，37℃水浴加热溶解，混匀后使用。溶液II请勿过分剧烈混匀，否则会产生大量气泡。

溶液II使用完后，一定要盖紧瓶盖，防止被空气中二氧化碳酸化。

溶液II有强碱性，溶液II和溶液III对人体都有刺激性，操作时请小心，并注意适当防护。

本试剂盒所有操作均在室温进行，操作时无需冰浴。所有离心也均在室温进行。

废液收集管在一次抽提中需多次使用，切勿中途丢弃。

使用说明：

1.取过夜菌至50毫升离心管内，5000g离心1分钟收集细菌沉淀，弃上清。再重复一次，每管总共收集100毫升过夜菌沉淀。通常大肠杆菌宜用LB培养过夜(16小时左右)至OD值为2-4。建议5000g(通常为5000rpm左右)室温离心1分钟，如沉淀不充分，则适当延长离心时间。时间过长或离心速度过快会使沉淀过于紧密，不利于加入溶液I后散开沉淀。直接倒掉上清，再倒入约50毫升菌液并重复上述操作，然后倒置于吸水纸上(可用普通草纸)，使液体流尽。如果细菌密度明显偏低，可考虑使用更多菌液，再重复上述操作1-2次。对于高拷贝质粒所用菌量一般不能超过150毫升，对于低拷贝质粒所用菌量一般不能超过200毫升。过量的细菌会导致后续的裂解不充分。

2.每管加入5毫升溶液I，重悬细菌沉淀。确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。

确认溶液I中已经添加了RNaseA。最高速度vortex10-20秒或更长时间，悬起沉淀。一定要充分混匀，对着光亮处观察应呈均匀的悬浊液，无明显细菌团块或絮块。如果没有vortex，可以用枪吹打沉淀使沉淀逐渐散开或用手指把沉淀弹开。

3.每管加入5毫升溶液II，轻轻颠倒离心管4-6次，室温放置3-5分钟，使细菌完全裂解，溶液透明。切勿vortex！vortex或其它剧烈操作会导致基因组DNA断裂，易导致最终所得质粒被基因组DNA污染。颠倒4-6次后，溶液应变得透明，无团块或絮状物。如果加入溶液I后细菌没有完全散开，那么颠倒4-6次后，可能还会有团块或絮状物。遇到有少量团块或絮状物产生的情况，可以增加颠倒次数3-5次，但总裂解时间不可超过5分钟。

4.每管加入5毫升溶液III，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生。切勿vortex！颠倒次数也不宜过多，否则易导致最终所得质粒的质量下降。

5.高速(5,000-10,000rpm左右)室温离心10-20分钟。如果速度较高例如10,000rpm左右，一般离心10分钟已经足够。离心更长时间例如20分钟，会使沉淀更紧密，更集中于管底，对于进一步提高质粒质量会有所帮助。速度较低时必须适当延长离心时间，使沉淀更加充分。离心时可以准备好质粒纯化柱，自制漏斗等，并在纯化柱上标上记号。

6.将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱内。高速离心2分钟，倒弃收集管内液体。质粒倒入质粒纯化柱后，可以不用等待，直接离心。倒弃收集管内的液体后，保留收集管继续使用。本步骤及后续的高速离心2分钟步骤，在离心速度达到10,000rpm时，离心2分钟即足够；在 离心速度为5,000rpm时，则离心时间可以延长到3-4分钟。

7.在质粒纯化柱内加入7毫升溶液IV，高速离心2分钟，洗去杂质，倒弃收集管内液体。加入溶液IV后可以不用等待，直接离心。倒弃收集管内的液体后，保留收集管继续使用。

8.高速离心2分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。

注意：倒弃收集管内液体后再离心，才能彻底去除微量的溶液IV。微量的溶液IV会影响质粒的质量。

9.将质粒纯化柱置于50毫升离心管上，加入2毫升溶液V至管内柱面上，放置2分钟。也可以用重蒸水或MiliQ级纯水替代溶液V，但是水的pH应不小于6.5。溶液V加入后放置时间稍长，对于增加质粒产量会略有帮助。

10.高速离心2分钟，所得液体中加入10毫升溶液VI，混匀后加到原质粒纯化柱内。加入溶液VI后必须混匀！可颠倒混匀，混匀后切勿离心。

11.高速离心2分钟，倒弃收集管内液体。

12.在质粒纯化柱内加入15毫升溶液IV，最高速离心2分钟，进一步洗去杂质，倒弃收集管内液体。加入溶液IV后可以不用等待，直接离心。倒弃收集管内的液体后，保留收集管继续使用。

13.高速再离心2分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。注意：倒弃收集管内液体后再离心，才能彻底去除微量的溶液IV。微量的溶液IV会影响质粒的质量。

14.将质粒纯化柱置于50毫升离心管上，加入2毫升溶液V至管内柱面上，放置2分钟。也可以用重蒸水或MiliQ级纯水替代溶液V，但是水的pH应不小于6.5。溶液V加入后放置时间稍长，对于增加质粒产量会略有帮助。如想得到较高浓度的质粒，可以加入1.3毫升溶液V洗脱。

15.高速离心2分钟，所得液体即为转细胞级超纯质粒。通常所得质粒浓度为0.1-0.3mg/ml。如果想得到高浓度的质粒，可以采用常规的乙醇沉淀的方法浓缩质粒。