蛋白免疫印迹Western Blot

蛋白免疫印迹（Western Blot, WB）是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法，用于检测经电泳或斑点杂交后固定于膜上的蛋白质的检测。特异、稳定的液态酶标抗体和相应的底物，保证了快速、准确的检测；避免了放射性物质的使用，现为蛋白分析的一种常规技术，对蛋白进行定性和半定量分析。
试验流程：
1. 蛋白质抽提：
组织样品：取适量（250~500mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1mL含蛋白酶抑制剂的总蛋白（或核蛋白）抽提试剂，匀浆后抽提总蛋白（或核蛋白）。
细胞样品：每份样品取10⁶～10⁷细胞，PBS清洗细胞，去PBS加0.1~1mL含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白（或核蛋白）。
2. 蛋白质定量：按BCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。
3. SDS-PAGE电泳：将准备好的样品液和预染蛋白 Marker分别上样，电泳分离蛋白。
4. 转膜：蛋白转移到PVDF膜，300mA恒流条件下，4°C转移90分钟左右。
5. 封闭和抗体孵育：膜在5%脱脂奶粉(磷酸化蛋白用BSA)溶液中室温封闭1小时；加入一抗4°C孵育过夜，抗原抗体结合；加入HRP标记的二抗体以结合一抗，室温孵育膜1小时。
6. western blot结果检测：化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。
7. western blot数据分析：可定性、半定量分析。
样品要求：
裂解样品总蛋白量＞500μg/样品；
细胞样品总蛋白浓度＞1mg/mL；
组织样品总蛋白浓度10-15mg/mL。
客户需提供新鲜或正确保存的蛋白、目的蛋白阳性表达样品（有阳性表达的细胞或组织），检测目的蛋白的一抗（建议由康颜生物代购）。
服务说明：
1. 建议提供目的蛋白阳性表达样品（纯蛋白、有阳性表达的细胞或组织）作为阳性对照；
2. 每张膜可检测1-9个样品；
3. 一抗需在正确条件下保存，避免污染及反复冻融；
4. 如需康颜生物进行数据分析，请另询价。
服务周期和价格：

服务名称	服务说明	收费标准	试验周期
Western blot	不含内参，客户提供抗体，每张膜可做1-9个样品。	1000元/膜/指标	1周

提交的产品和资料：
AP显色提供WB膜一张，HRP压片提供最终的X光片，另附一份膜或胶片扫描图。蛋白浓度以及灰度分析（如果需要）及实验报告。