定量PCR原理
1) 原理
所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在实时荧光定量PCR技术的发展过程中，两个重要的发现起着关键的作用：（1）在90年代早期，Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现，它能降解特异性荧光记探针，因此使得间接的检测PCR产物成为可能。（2）此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。这两个发现的结合以及相应的仪器和试剂的商品化发展导致real-time Q-PCR方法在研究工作中的运用。
2) Ct值的含义
C代表Cycle，t代表threshold，每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。
3）操作步骤
1. 分光光度计检测RNA的浓度与纯度
2. 反转录:
引物（2μM） 1μl
组织总RNA 200ng
加水至 12μl
70℃10min，快速插入冰水中。离心后，加入：
5×buffer 4μl
DTT（100mM） 1μl
dNTP（10mM） 各1μl
SuperScript酶（10U/μl） 1μl
3.混匀后在42℃反应50 min。70℃15min灭活逆转录酶。-20℃保存。
4. PCR扩增：
反应体系：
dNTP（each 10mM） 1μl
10×buffer 5μl
MgCl2 （25mM） 3μl
上游引物（50μM） 0.5μl
下游引物（50μM） 0.5μl
探针（50μM） 0.3μl
反转录产物 8μl
Taq DNA聚合酶（5U/μl） 0.3μl
加水至 50 μl
PCR反应条件：94℃2min；
93℃25 s, 55℃30 s, 72℃40 s，40个循环；
反应在实时荧光PCR仪器LightCycler (Roche)上进行，利用配套软件进行检测和分析
客户提供样本和引物，其他试剂公司出。
