小鼠生物发光活体成像



（一）技术原理
1. 标记原理
哺乳动物生物发光，一般是将Firefly luciferase基因（由554个氨基酸构成，约50KD）即荧光素酶基因整合到预期观察的细胞染色体DNA上以表达荧光素酶，培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株，当细胞分裂、转移、分化时, 荧光素酶也会得到持续稳定的表达。基因、细胞和活体动物都可被荧光素酶基因标记。将标记好的细胞接种到实验动物体内后，当外源（腹腔或静脉注射）给予其底物荧光素(luciferin)，即可在几分钟内产生发光现象。这种酶在ATP，氧存在的条件下，催化荧光素的氧化反应才可以发光，因此只有在活细胞内才会产生发光现象，并且发光光强度与标记细胞的数目线性相关。
除Firefly Luciferase外，有时也会用到Renilla Luciferase。二者的底物不一样，前者的底物是荧光素（D-luciferin），后者的底物是coelentarizine。二者的发光波长不一样，前者所发的光波长在540~600nm，后者所发的光波长在460~540nm左右。前者所发的光更容易透过组织，后者在体内的代谢比前者快，而且特异性没有前者好，所以大部分活体实验使用Firefly Luciferase作为报告基因，如果需要双标记，也可采用后者作为备选方案。
荧光素酶的发光是生物发光，不需要激发光，但需要底物荧光素。荧光素在氧气、ATP存在的条件下和荧光素酶发生反应，生成氧化荧光素(oxyluciferin)，并产生发光现象。

2. 底物荧光素的特点
荧光素由于诸多优点得到广大科研人员的青睐，主要特点如下：
(1) 荧光素不会影响动物的正常生理功能。
(2) 荧光素是280道尔顿的小分子，水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透细胞膜和血脑屏障。
(3) 荧光素在体内扩散速度快，可通过腹腔注射或尾部静脉注射进入动物体内。腹腔注射扩散较慢，持续发光长。荧光素腹腔注射老鼠后约1min后表达荧光素酶的细胞开始发光，10min后强度达到稳定的最高点，在最高点持续约20~30 min后开始衰减，约3h后荧光素排除，发光全部消失，最佳检测时间是在注射后15~35min之间；若进行荧光素静脉注射，扩散快，但发光持续时间很短。科研人员根据大量的实验总结出荧光素的合适的用量是150mg/kg，即体重20克的小鼠需要3毫克的荧光素。
(4) 观察时间的间隔没有最短限制，只要观察的条件控制一致就可以。虽然底物在动物体内有一定的代谢过程，但是上一次底物的残留曲线可以知道，可以控制对下一次观察结果的影响。
3. 光学原理
光在哺乳动物组织内传播时会被散射和吸收，光子遇到细胞膜和细胞质时会发生折射现象，而且不同类型的细胞和组织吸收光子的特性并不一样。血红蛋白（hemoglobin）是造成体内可见光被吸收的主要因素，其吸收可见光中蓝绿光波段的大部分。但是在可见光大于600纳米的红光波段，血红蛋白的吸收作用却很小。因此，在偏红光区域, 大量的光可以穿过组织和皮肤而被检测到。利用活体动物生物发光成像技术最少可以检测到皮下的几百个细胞。当然，由于发光源在老鼠体内深度的不同可看到的最少细胞数是不同的。一般认为，每一厘米深度，发光强度衰减10倍，血液丰富的组织或器官（比如心脏、肝脏、肺脏）衰减多，与骨骼相邻的组织或器官衰减少。在相同的深度情况下，检测到的发光强度和细胞的数量具有非常好的线性关系，可由仪器量化检测到的光强度，反映出细胞的数量。
（二）小鼠生物发光活体成像技术特点


（三）生物发光活体成像用途


（四）实验操作流程
1. 肿瘤细胞标记
首先用萤光素酶标记所要研究的肿瘤细胞，我们利用带luciferase基因，puromycin或blasticidin抗性的慢病毒载体，先包装成慢病毒，然后感染肿瘤细胞，最后抗性筛选出稳转luciferase的肿瘤细胞。接下来可以继续按照客户需求对该稳转细胞株进行其它基因改造操作。
2. 体外预实验检测
需要检测的肿瘤细胞标记后，在活体成像前，可以通过检测荧光素酶的表达强度，绘制标记细胞的发光梯度曲线等。体外预实验是作为小动物活体成像解决方案中不可缺少的一部分。比如，利用体外预实验初步检测转染荧光素酶的肿瘤细胞发光值。
3. 稳转luciferase细胞接种小鼠
接种方式按照实验目的不同有几种，原位接种，皮下接种，腹腔接种以及静脉接种，可分别观察原位瘤，皮下瘤以及转移瘤等。如果是人源的肿瘤细胞，必须用裸鼠作为受体，如果是鼠源细胞系则无所谓，但是前提是所用细胞必须能成瘤。
4. 活体成像
细胞接种一段时间后，可以进行活体成像检测。首先麻醉实验动物，可采用异氟烷（isoflurane）或克他命/甲苯噻嗪（ketamine/xylazine）混合液麻醉实验动物。 接着注射底物荧光素，最佳的检测时间是在注射后10到35分钟之间。但需要注意的是，对于不同的动物模型，发光动力学过程并不完全一致，最好先进行预实验确定何时发光信号最强。

（五）厦门安提海拉生物科技有限公司稳转luciferase细胞株列表

黑色素瘤	B16-luc	puromycin,blasticidin两种抗生素筛选可供选择;皮下成瘤，尾静脉2星期，强转移能力
	B16F10-luc	puromycin,blasticidin两种抗生素筛选可供选择;皮下成瘤，尾静脉2星期，强转移能力
	SK-Mel-1-luc	puromycin,blasticidin两种抗生素筛选可供选择;皮下成瘤
	A375-luc	puromycin,blasticidin两种抗生素筛选可供选择;皮下成瘤
前列腺癌	PC3-luc	puromycin,blasticidin两种抗生素筛选可供选择;皮下成瘤
	RM-1-luc	puromycin,blasticidin两种抗生素筛选可供选择;皮下成瘤
	DU 145-luc	puromycin,blasticidin两种抗生素筛选可供选择;皮下成瘤
肝癌	Hep G2-luc	puromycin,blasticidin两种抗生素筛选可供选择;皮下成瘤
	7721-luc	puromycin,blasticidin两种抗生素筛选可供选择;皮下成瘤，2个月转移到肺，尾静脉不能转移
	SK-Hep1-luc	puromycin,blasticidin两种抗生素筛选可供选择;皮下成瘤
	Hep3B-luc	puromycin,blasticidin两种抗生素筛选可供选择;皮下成瘤
	Hep1-6-luc	puromycin,blasticidin两种抗生素筛选可供选择;皮下成瘤
乳腺癌	MDA-MB-231-luc	puromycin,blasticidin两种抗生素筛选可供选择;皮下成瘤，原位瘤，尾静脉肺转移瘤
	4T-1-luc	puromycin,blasticidin两种抗生素筛选可供选择;皮下、原位、尾静脉肺转移
	MCF-10A-luc	puromycin,blasticidin两种抗生素筛选可供选择;皮下成瘤
	MDA-MB-435-luc	puromycin,blasticidin两种抗生素筛选可供选择;皮下成瘤，原位癌，尾静脉肺转移成瘤
	MCF7-luc	puromycin,blasticidin两种抗生素筛选可供选择;皮下成瘤
肺癌	A549-luc	puromycin,blasticidin两种抗生素筛选可供选择;皮下成瘤，成瘤率75%左右
	LLC-luc	puromycin,blasticidin两种抗生素筛选可供选择;皮下成瘤能力强
甲状腺癌	SW579-luc	puromycin,blasticidin两种抗生素筛选可供选择;皮下成瘤能力强
	TT-luc	puromycin,blasticidin两种抗生素筛选可供选择;皮下成瘤
胰腺癌	SW1990-luc	puromycin,blasticidin两种抗生素筛选可供选择;皮下成瘤
	PANC-1-luc	puromycin,blasticidin两种抗生素筛选可供选择;皮下成瘤
骨肉瘤	U-2OS-luc	puromycin,blasticidin两种抗生素筛选可供选择;皮下成瘤
	Saos-2-luc	puromycin,blasticidin两种抗生素筛选可供选择;皮下成瘤
	SW 1353-luc	puromycin,blasticidin两种抗生素筛选可供选择;皮下成瘤
结直肠癌	HCT116-luc	puromycin,blasticidin两种抗生素筛选可供选择;皮下，尾静脉2个星期转移到肺脏
	Lovo-luc	puromycin,blasticidin两种抗生素筛选可供选择; 皮下成瘤
	SW480-luc	puromycin,blasticidin两种抗生素筛选可供选择; 皮下成瘤
	SW620-luc	puromycin,blasticidin两种抗生素筛选可供选择; 皮下成瘤，尾静脉2个星期转移到肺脏