GB Quick Blood Genotyping具有快速制备基因组DNA及定量PCR扩增性能的试剂盒，它能迅速地从全血中提取基因组DNA，无需繁琐的DNA纯化过程。提取的基因组DNA可以立即在qPCR反应中使用。 GB Quick Blood Genotyping试剂盒主要由两个部分组成：样品的预处理，及利用荧光PCR对基因组DNA的扩展。它使用了Taq聚合酶的自动“热启动”功能，增加了PCR的敏感性，特异性和产物的产量，可提供卓越的等位基因鉴别。

主要特点：

直接从新鲜或者冰冻全血进行扩增。

不需要纯化基因组DNA，步骤简单。

减少样品互相污染的风险，节约时间和降低测试成本。

与现有的工作流程、标准操作以及常规试验匹配。

产品信息：

每个GB Quick Blood Genotyping试剂盒以足够准备400个定量PCR反应为计算单位。

组分名称 装量 储存条件 Lysis/Precipitation Buffer 30 ml×1瓶 室温 Wash Buffer 40 ml×1瓶 室温 Dissolve Buffer 20 ml×1瓶 室温 Stabilization Buffer 6 ml×1瓶 室温 2x qPCR Supermix* 1 ml×5支 -20 ℃ 40x Primers/Probe Mix(not provided) 0.25 ml×1支 -20 ℃  (in the dark) ROX Reference Dye (25 μM) 0.5 ml×1支 -20 ℃

存储条件：
* -20℃长期储存2xqPCR Supermix。但一旦解冻它可以存放在4℃ 一个月，以尽量减少多次冻融。
若在数个月的定期使用，请将其分装。

操作流程：

A. 准备基因组DNA模板

1. 取25μl全血于1.5ml Eppendorf离心管内，加入75μl Lysis/Precipitation Buffer快速震荡混和或移液器吸头上下吸取5次使样本和试剂混匀，室温放置5min。将以上的离心管移至台式离心机，管柄朝外放置以便离心后的沉淀位于底部的管柄方向，用最大的速度14,000 rpm离心2 分钟，然后用P-200移液枪头在不接触到沉淀物的前提下尽可能地移走全部上层红色液体。(如图所示)

2. 加入100μl Wash Buffer，快速震荡混和或移液器吸头上下吸取5次混匀，然后用最大的速度14,000 rpm离心2 分钟。用P-200移液器轻轻移走上清，沉淀物颜色应为粉红色或透明状，如果为血红色或颜色还较深，可重复步骤2。

3. 加入50μl Dissolve Buffer，快速震荡混和，然后放置65℃水浴5mins。

4. 加入15μl Stabilization Buffer涡旋混匀，短暂离心使溶液集中管底。此液体即可直接用于荧光PCR。同时也可将其存放在-20℃ 以备再次使用。

5. 根据仪器的要求，参考图表一选取适量的DNA模板用于qPCR不同的 反应体系。

B. qPCR 扩增

图表-1 不体系的PCR反应体系参照表

反应中成分 5μl体系 10μl体系 20μl体系 25μl体系 50μl体系 终浓度 DNA 模板（μl） 1 2 4 5 10 2xqPCR Supermix （μl） 2.5 5 10 12.5 25 1x 荧光探针(40x )  （μl） 0.125 0.25 0.5 0.625 1.25 1x ROX Reference Dye (25 μM)* 0.1/0.01 μl 0.2/0.02 μl 0.4/0.04 μl 0.5/0.05 μl 1/0.1 μl 500 nM/50 nM 灭菌蒸馏水 to 5 μl to 10 μl to 20 μl to 25 μl to 50 μl

图表-2根据各仪器推荐反应体系进行调整ROX加量

使用仪器 ROX染料 在25 ul 反应体 系中用量 最终ROX染料的浓度 AB 7300, 7900HT, 7000 and 7700 0.5 μl 500 nM AB 7500 0.05 μl 50 nM

图表-3提供25ul的反应体系设置作为一个例子，同时需要设置阴性对照以确定是否污染。

反应中成分 25 μl样品反应体系 25 μl阴性对照体系 DNA 模板（μl） 5 --- 2xqPCR Supermix（μl） 12.5 12.5 荧光探针(40x )（μl） 0.625 0.625 ROX Reference Dye (25 μM)* 0.5/0.05 μl 0.5/0.05 μl 灭菌蒸馏水 to 25 μl to 25 μl

在25ul反应体系中，DNA模板的添加量通常在100ng以下。因不同样品的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。

1. 盖紧PCR管/盘，轻微混匀，确保所有的成分都在管/盘的底部，必要时离心。 2. 将PCR管放入荧光定量PCR仪中，程序设置如下(图表-4)，开始分析。

图表-4 PCR程序

温度 94℃ 95℃ 60℃ 时间 2分钟 15秒 60秒 循环 1次 40次

注意 1. 建议在不同的区域 （如：不同的实验室，或不同的实验工作台）进行样品处理与qPCR的设置，以消除环境所带来的交叉污染。 2. 处理样品前，请用75%的酒精试纸，擦洗移液抢；所用的移液抢头内含有滤芯，而且无DNA酶、RNA酶。 3. 血样的新鲜度对实验的成功起着很大的作用。