| 普通RT-PCR | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 实验目的：目的基因表达的相对定量。 实验原理：利用反转录酶，把mRNA反转录生成 cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，即RT-PCR，RT-PCR对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。 实验仪器：Eppendorf Centrifuge5804R、UV-visible Spectrophotometer、BIO-RAD Gel DocTM XR、Multitene TC9600-G-230V LabNet。 实验内容与方法： 1. 查找基因序列或相关参考文献，设计或查找特异性的引物，并化学合成引物； 2. 提取样品总RNA，分光光度法测定总RNA含量，电泳鉴定总RNA完整性； 3. 根据基因属性进行反转录，得到cDNA模板； 4. 使用1中合成的引物进行PCR预实验与正式实验； 5. 结果分析，提交实验报告。 实验信息（客户提供）： 1. 基因信息： 待测样品种属： 基因全称与ID： 备注说明： 2. 实验材料： （1）样本材料； （2）试剂材料。 服务周期：2周至8周（具体视样品数而定）。 结果提交：提交实验报告书（包括实验材料、试剂、仪器、实验过程方法、结果及分析）、原始数据、图片，文本或电子版。 实验范例：RT-PCR法检测基因1/基因2基因的表达 1. 引物设计与合成 内参 primer (527bp): F: 5’-CTACAATGAGCTGCGTGTGG-3’ R: 5’ -CGTGAGAAGGTCGGAAGGAA -3’ 基因1 primer (320bp): F:5’ -CTGAAGAGCGTGAAGGTTGGA-3’ R:5’ -AAGGATGTGGAGGGAGATGAGT-3’ 基因2 primer(600bp): F:5’- AAATTAATCATATGTGCAGCTGCTCCCCGGTGCAC-3’ R:5’ -GCTTAYGGGTCCTCGATGTC-3’ 2. RNA提取与质量检测 RNA的浓度＝OD260×稀释倍数×0.04μg/μL，OD260/280 在1.8～2.1视为抽提的RNA的纯度很高；总RNA琼脂糖凝胶电泳28S、18S、5S三条带较为完整。 3. 基因1/基因2电泳图 4.基因1/基因2灰度分析
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