经典法质粒DNA提取

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xuanya
中国/美国
2021-08-18 12:46

上海烜雅生物科技有限公司

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上海烜雅生物科技有限公司
黄经理
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产品属性
保存条件常温运输和保存
保质期两年
英文名Column Plasmid DNAOUT
数量860
供应商上海烜雅生物科技有限公司
规格50 次
产品说明
经典法质粒DNA提取产品及特点:
本试剂盒是用于质粒DNA小量制备与纯化的试剂盒。菌体先经碱裂解法处理,再通过离心吸附柱,专一结合DNA,最后洗去杂质,高效快速提取质粒DNA,全套操作可以在30分钟之内完成。使用本试剂盒可从1-5mL过夜培养的菌液纯化得到高达20ug的高纯度质粒DNA(OD260/OD280=1.8-2.0),可以直接用于酶切、转化、测序及PCR等。
1.快速、步骤少,整个操作在半个小时之内完成。
2.不需要预平衡离心吸附柱。
3.洗柱液即开即用,不需要额外加乙醇。
4.纯度高,采用本试剂盒提取的质粒OD比值在1.8-2.0之间。
5.产量高,每毫升过夜培养的细菌可以提取到2-5ug/mL。
6.用途广,适用于低拷贝和高拷贝质粒。
7.价格低,比多数国内同类产品的价格更便宜。

经典法质粒DNA提取运输及保存:
常温运输和保存,RNaseA溶液需要-20℃保存,有效期一年。
自备试剂:无

经典法质粒DNA提取使用方法
1.先将全部RNaseA溶液全部加入到溶液A中,摇匀后再取用,未用完的溶液A最好在4℃保存。
2.从筛选平板上挑取单菌落至含抗生素的培养基中,37℃震荡培养12-16小时(摇床转速200-300)。
经典法质粒DNA提取注意:建议使用LB培养基,营养更丰富的培养基会使菌体浓度过高,超过纯化系统处理能力而降低DNA质量。另外,延长培养时间有利于提高质粒DNA浓度,但是菌液培养过长时间会因细胞死亡、裂解而造成质粒DNA浓度降低。
3.用1.5mL离心管收集1-4mL过夜培养饱和菌液,室温12,000rpm离心1分钟,弃上清,再短暂离心,吸弃残留液体。
4.加入250uL溶液A,用枪头充分吹打使菌体重悬(此步在冰上操作效果更佳)。
经典法质粒DNA提取注意:细胞未充分悬浮会影响后续操作,可以使用漩涡振荡器帮助混匀或使用Tip吸头吹打沉淀至完全混匀。
5.加入250uL溶液B(如果溶液B有沉淀,用前须37℃加热溶解后冷却到室温方可使用),温和反复颠倒混匀4-6次,看到溶液变粘即可,然后冰上放置不超过4-5分钟。注意:此步处理不能超过5分钟,否则DNA的碱损伤比较严重。同时千万不要剧烈振荡,否则基因组DNA断裂产生的片段非常容易污染质粒DNA。溶液B用后需要将盖拧紧存放,否则空气中的二氧化碳会进入溶液,形成碳酸,中和溶液B中的NaOH,降低其效率)。
6.加入350uL冰上预冷的溶液C,反复颠倒混匀4-6次,可见白色沉淀物产生,然后冰上放置至少5分钟。
7.最高转速(12,000rpm以上)4℃离心5分钟,小心将上清液转移到离心吸附柱中。由于此时的溶液比重较大,有时候出现沉淀漂浮是正常现象,取上清时避开漂浮的沉淀即可。如果此步的离心在室温进行,更容易出现沉淀物漂浮的现象。
8.静置2分钟以让质粒DNA与吸附柱充分结合,此步十分重要。
9.室温12,000rpm离心1分钟,弃收集管中的废液。
10.加入500uL的通用洗柱液,室温12,000rpm离心1分钟,弃收集管中废液。注意:通用洗柱液中含乙醇,用后需要将盖拧紧存放,否则乙醇会挥发。
11.重复上步1次。
12.室温12,000rpm离心1分钟,甩干残留液体。此步不能省略,否则残留乙醇会影响DNA的后续使用(如DNA上样时不能沉淀到加样孔中)。
13.将离心吸附柱置于一个新的1.5mL塑料离心管(自备)中,加入30-100uL65-80℃预热的DNA洗脱液2.0,室温放置2分钟。常温的DNA洗脱液2.0也可以用于洗脱,但产量稍微有所降低。
14.室温12,000rpm离心1分钟,离心管底溶液即质粒DNA。
15.由于xuanya的吸附柱结合DNA能力较强,如果再加适量DNA洗脱液2.0到离心吸附柱中,往往还能洗脱下很多质粒DNA(相当于第一次洗脱的20-30%),但注意不要使用上步得到的DNA洗脱液2.0来洗脱。

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