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真菌总RNA提取

价格：￥1

品牌：xuanya

产地：中国/美国

最新更新日期：2021-08-19 21:06

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上海烜雅生物科技有限公司

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产品属性

保存条件

常温运输和保存

保质期

两年

英文名	Column Fungal RNAOUT

数量

100

供应商	上海烜雅生物科技有限公司

规格

50 次

产品说明

真菌总RNA提取产品及特点：
本产品是在xuanya真菌RNAout基础上改进的柱式产品，跟真菌RNAout相比，它具有下列特点：
1. 柱式操作，更加简单快捷，整个过程只需要约30分钟。
2. RNA纯度高，OD260/280一般都在2.0左右，可直接用于RT-PCR、 Norther杂交、microarray hybridization、cDNA合成等。
3. RNA产量高，一般在20-70ug/mL酵母培养物(约2.0 ×107个细胞)。
4. 非酶细胞破裂法，适用于各种形态和各个种属的真菌及革兰氏阳性细菌，包括 Candida albican、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomycespombe、Pichiapastoris、Bacillus subtilis、Staphylococcusaureus 等。

真菌总RNA提取运输及保存：
常温运输，4℃保存，有效期一年。
自备试剂：氯仿。

真菌总RNA提取使用方法
1. 将 50 mg 左右的干菌丝(或 100 mg 左右的鲜菌丝、或适当数量的真菌菌落)转移到 1.5 mL 塑料离心管中。如果是液体真菌培养物，则直接将 1-10 mL 液体真菌在 1.5 mL 塑料离心管中 12000-15000 g 离心 1 分钟，并弃尽液体培养基（可以分多次离心）。
2. 加入 0.4 mL 溶液 A 并充分吹打混匀。如果 A 溶液存放时产生沉淀，请置于 65℃融化，用前充分摇晃均匀。
3. 加入 0.4 mL 溶液 B，剧烈振荡 30 秒。
4. 65℃保温 5 分钟。
5. 室温 12000-15000 g 离心 3-5 分钟，转移上清到一干净的 1.5 mL 塑料离心管中。
6. 再加入 0.1 mL 溶液 B 和 0.1 mL 自备氯仿，振荡混匀 30 秒。
7. 室温12000-15000 g离心3-5分钟，转移上清到一自备的、干净的5 mL 塑料离心管中。
8. 加入相当于上清 3 倍体积的溶液 C（约 1.2-1.5 mL）和 1 倍体积的溶液 D（约 0.4-0.5 mL），充分混匀。
9. 将混合液（约 2.5mL）分 3-4 次转移到离心吸附柱中。每次 13000-15000 g 室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。
10. 用 0.5 mL 通用洗柱液到离心吸附柱中，室温离心半分钟，弃收集管中的穿透液。
11. 一次洗涤一般足够去除杂质。但如果样品 OD260/280 比值不高，可以再用 0.5 mL 通用洗柱液重复此步一次。
12. 室温离心半分钟。此步十分重要，否则残留的洗柱液会影响 RNA 的使用。
13. 将离心吸附柱转移到一自备的 RNase-free 1.5 mL 塑料离心管中，加入 30-100 uL RNA 洗脱液。
14. 室温离心半分钟，离心管中溶液即为 RNA 样品，可以立即使用或存放于 -80℃待用。
15. RNA 完整性的电泳检测：如果需要做 Northern 杂交，强烈建议用户使用甲醛变性胶进行 RNA 电泳，因为非变性胶不能分离所有的 RNA 分子（BioTechniques，28： 414，2000）。如果是简单检测，可以使用 TAE 或xuanya的 SuperBuffer-2 DNA/RNA 两用快速电泳液，但文献报道必须使用变性上样液（BioTechniques，9:558，1990）。普通 DNA 上样液不含变性剂，也没经过去 RNase 处理，所以最好不要使用。尤其需要注意的是不要使用 TBE 进行 RNA 电泳，因为 TBE 所含是研究多糖的经典方法----络合法中的关键成分，通过与 RNA 核糖中的羟基发生络合反应，形成 RNA 分子内或 RNA 分子间的络合复合物，使同样长度的 RNA 具有不同的泳动速度，电泳条带弥散，同时有大的 RNA 络合复合物迟留在加样孔中（一般会误以为是基因组 DNA 污染）。RNA 分子内或 RNA 分子间的络合物的形成的多少和比例又与与 RNA 的数量比例有关，而 RNA 样品中污染的其他多糖也会参与此反应，使对 RNA 电泳的影响更复杂，所以 TBE 对 RNA 电泳的影响没有规律性和重复性。有的样品可以使用有的又不行，最好是避免使用。
16. RNA 产量产率测定：将 5-10 μL RNA 溶于 TE 缓冲液中(pH7.5-8.2 之间)检测其在 OD260 的光吸收。通过光吸收可以得出 RNA 浓度（1 OD260 的 RNA=40 ， μg/mL），进而计算出 RNA 的产量（浓度 X 体积)和产率(RNA 产量/细菌用量)。注意不要将 RNA 稀释在 DEPC 水中检测 OD260 和 OD280，否则光吸收比在 TE 中测得的低 10%-15%。
17. RNA 纯度测定：无污染的总 RNA 的 OD260/OD280 一般在 1.8-2.1 之间(具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关)，OD260/OD230 一般在 2.0-2.3 之间，如果低于或高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质或多糖的污染，但一般不影响 RT-PCR 等反应。蛋白质污染可以通过酚/ 氯仿抽提一次然后酒精沉淀去除，DNA 和多糖污染可以分别用xuanya的 DNA Erasol 和 PS Erasol 去除。测 OD 时 RNA 不能过度稀释使 OD 读数低于仪器的有效范围。

真菌总RNA提取疑难解答
Q：为何从酵母中提取的总 RNA 有 3 条小带？
A：它们分别是 70 bp 左右的 tRNA, 120 bp 左右的 5 S RNA, 160 bp 左右的 5.8 S RNA。

Q：上样孔里的红色荧光物一定是污染的基因组 DNA 吗？
A：不是。用 TAE 或 TBE 电泳液和非变性胶电泳 RNA 时容易产生此现象， xuanya初步研究发现大部分红色荧光物是变性不充分的单链 RNA 通过碱基互补或通过络合（如果使用 TBE 作电泳液的话）形成的复合物加 RNase 处理后，这些红色荧光物一般会消失。为避免此现象，建议最好使用甲醛变性胶电泳。如果需要使用非变性胶，也必须在上样前使 RNA 变性。使用xuanya优化的上样/变性/染色三用溶液 RNAON 可以使 RNA 在非变性胶上电泳时也有较好分辨率。使用非变性胶时，可以使用 TAE 或超快电泳液 SuperBuffer-2，最好不要使用 TBE 缓冲液，因为 TBE 中的能与 RNA 的多羟基形成复合物，RNA 很难形成锐利的条带。

真菌总RNA提取Q：如何确认和去处除污染的基因组 DNA？
A：如果怀疑有 DNA 污染，可以用 RNase 处理 RNA 样品，然后再电泳。如果上样孔里的红色荧光物不消失，则表示是基因组 DNA 污染。进一步确认可以使用 PCR 扩增法。去除污染的 DNA 可以使用非酶的 DNA 去除剂 DNA Erasol 或 RNase-free DNase，由于 RNase-free DNase 一般都有残留的 RNase 污染，所以必须严格按照厂家提供的使用手册进行操作。

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