利福平对革兰氏阳性菌活跃，但对革兰阴性菌较不活跃。它通过抑制DNA依赖的RNA聚合酶干扰核酸的合成。耐利福平抗性可以快速获得。抗性程度取决于RNA聚合酶的突变位点。利福平在浓度约0.01-02g/mL（50％有效剂量）时灭活细菌RNA聚合酶（RNAP）。利福平对分枝杆菌，包括结核杆菌，麻风杆菌等微生物具有广泛的活性。利福平对革兰阳性菌，如金黄色葡萄球菌，链球菌，肺炎球菌具有高活性，但对革兰氏阴性菌活性较低。利福平的抑菌活性在pH值5.5-8.0之间几乎保持不变。