产品简介：
副结核分枝杆菌（Mycobacterium paratuberculosis）是一种放线菌， 短粗杆菌，长 1—2 微米，染色均匀，但偶尔较长的类型表现染色和不染色的 节段相交替。在牛和羊上产生“约翰病”。在山羊上实验产生相似的疾病。豚 鼠、家兔、大鼠和小鼠不发病。很大的剂量在实验室动物上产生轻度结节局部 病变，与草分枝杆菌所引起者相类似。本产品是根据 PCR 原理开发的副结核分 枝杆菌检测试剂盒，它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供 DNA 模板。
2. 引物经过精心优化，专一性强，只扩增副结核分枝杆菌，与其他病原没有
交叉反应。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. PCR mix 中含上样染料，PCR 后可以直接上样电泳。
5. 本试剂盒足够做 40μL 体系的 PCR 50 次，但只能用于科研。

规格及成分：

成 份	编号	十孔盒包装
PCR MagicMix 3.0	90805	1 mL（红盖）
超纯水	100935	1 mL（亮黄色）
副结核分枝杆菌PCR 引物混合液	13-67850yw	100 μL（白盖）
副结核分枝杆菌PCR 阳性对照（1×10E8 拷贝/μL）	60908-67850pc	50 μL（黄盖）
使用手册	13-67850sc	1份

运输及保存：
低温运输，-20℃保存，保存期限为一年。阳性对照需要单独放置，不要污染其他试剂。
自备试剂：
样本DNA。
使用方法：
一、样品 DNA 的制备
1. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数核酸提取 试剂盒兼容。可以选用本公司柱式细菌 DNAout，其使用手册可以从本公 司网站搜索产品名称或产品编号 60802-50 下载。 2. 如果有 N 个样品，则需要做 N+2 个提取，包括一个样品制备阳性对照和一 个样品制备阴性对照。样品制备阳性对照是在适量水（取决于试剂盒要求 的样品起始量）中加 10μL 副结核分枝杆菌 PCR 阳性对照的 10000 倍稀 释液而得，样品制备阴性对照是直接用水。提取结束后最后得到模板 DNA 放冰上待用。
二、设置 PCR 反应（40μL 体系）
3. 对 N+2 个样品，在 PCR 时需要增加一个 PCR 阳性对照和一个 PCR 阴性对照，故需要设置 N+4 个反应。在 N+4 个 PCR 管中分别加入下列成分：

成分	样品管 N+2 个	PCR 阴性对照	PCR 阳性对照
PCR MagicMix 3.0	各 20 μL	20 μL	20 μL
副结核分枝杆菌PCR 引物混合液	各 2 μL	2 μL	2 μL
N+2 个样品 DNA 模板	各 18 μL	-	-
PCR 阴性对照（水）	-	18 μL	-
PCR 阳性对照（副结核分枝杆菌PCR 阳性对照的 10000 倍稀释液）	-	-	18 μL

4. 按下表设置 PCR 反应：

过程	温度	时间
预变性	95℃	5min
PCR反应 （35 个循环）	95℃	30sec
	55℃	30sec
	72℃	30 sec
最后延伸	72℃	7min

三、电泳检测
5. 取 10-20 μL PCR 产物。电泳检测 PCR 产物。本产品提供的 PCR Mix 在 扩增结束后可以直接上样，不需要另外再加 loading buffer。PCR 产物阳 性对照必须有 375bp 大小的条带出现，阴性对照必须无任何扩增，否则实 验无效。对没有扩增产物的样品，可以稀释 10 倍后重复 PCR 扩增以排除 PCR 抑制剂的感染。