pCMV-Mito-AT1.03 (线粒体ATP荧光探针)是自行研发的含有CMV启动子用于在哺乳动物线粒体中表达带有线粒体定位信号(Mitochondrial localization signal, MLS)的AT1.03蛋白以作为细胞核ATP荧光探针的工具质粒。本质粒表达的ATP荧光探针被称为ATeam，即基于FoF₁-ATP合成酶ε亚基的ATP指示剂(Adenosine 5-Triphosphate indicator based on Epsilon subunit for Analytical Measurements)。AT1.03是一种低亲和力的ATeam (Kd=3.3mM at 37℃)，可以检测毫摩尔级的ATP水平。pCMV-Mito-AT1.03质粒在转染哺乳动物细胞后，AT1.03蛋白由于带有线粒体定位信号主要分布在线粒体中，适合用于实时监控线粒体内的ATP浓度变化。

pCMV-Mito-AT1.03 (线粒体ATP荧光探针)也可以用作线粒体荧光探针，在活细胞中或细胞固定后标记线粒体的位置和形态。

AT1.03蛋白是以荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)为基础的实时监测单个活细胞内的ATP水平及其实时变化的ATP荧光探针。带有线粒体定位信号的该荧光探针由N端的青色荧光蛋白(cyan fluorescent protein) mseCFPΔC11 (激发光波长435nm，发射光波长475nm)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的FoF₁-ATP合成酶的ε亚基以及C端的黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein) cp173-mVenus (激发光波长515nm，发射光波长527nm)融合而成(参考图1)。枯草芽孢杆菌的FoF₁-ATP合成酶的ε亚基是几乎最小的ATP结合蛋白(14kDa)，它由一个N端β桶状结构域和两个C端α螺旋结构域组成。作为基于FRET的ATP荧光探针，FoF₁-ATP合成酶的ε亚基具有几个突出优点：ε亚基与ATP结合，但不水解ATP；结合ATP，但不结合ADP、GTP、CTP以及UTP；当ATP结合时，ε亚基发生很大的构象变化形成一个折叠的构象(folded form)，从而使N端的青色荧光蛋白以及C端的黄色荧光蛋白得以在空间上接近，而发生荧光共振能量转移(激发光波长435nm，发射光波长527nm)。带有线粒体定位信号的AT1.03蛋白和不带有线粒体定位信号的AT1.03蛋白相比，完全保留了AT1.03蛋白的以FRET为基础的ATP荧光探针的功能。

图1.Mito-AT1.03蛋白结构图，N端融合了线粒体靶向信号(细胞色素c氧化酶VIII双链体)。Cox x2为线粒体定位信号。

pCMV-Mito-AT1.03质粒转染Hela细胞后的ATP荧光探针表达效果请参考图2。

图2.pCMV-Mito-AT1.03质粒转染Hela细胞后的ATP荧光探针表达效果图。A图为明场照片，B图为荧光照片。

AT1.03的荧光信号在pH7.1-8.5之间非常稳定，这样AT1.03的荧光信号在正常细胞质内(pH7.3左右)几乎不会发生波动。ATP的结合常数_Kon为1.7×10^-2mM^-1s^-1，ATP的解离常数_Koff为9.8×10^-2s^-1，因此AT1.03可用于监控细胞内高达0.1s^-1 ATP的动态变化，特别适合用于实时监测超短时间内的ATP浓度变化。带有线粒体定位信号的AT1.03蛋白和不带有线粒体定位信号的AT1.03蛋白相比，pH稳定性、结合常数、解离常数等性能基本一致。

本质粒为卡那霉素抗性，转染细胞后，可使用G418筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。

pCMV-Mito-AT1.03质粒的主要信息如下：

pCMV-Mito-AT1.03质粒(6274bp)的图谱如下：

pCMV-Mito-AT1.03中没有的酶切位点(Restriction enzymes that do not cut pCMV-Mito-AT1.03)包括：

pCMV-Mito-AT1.03中的单酶切位点(Restriction enzymes that cut pCMV-Mito-AT1.03)包括：

如需对pCMV-Mito-AT1.03质粒中插入片段Mito-AT1.03进行测序时，推荐使用的正向测序引物T3和反向测序引物T7的序列如下：

T3 primer (620-639): 5 AATTAACCCTCACTAAAGGG 3

T7 primer (2749–2797): 5 GTAATACGACTCACTATAGGGC 3

包装清单：

保存条件：

-20℃保存。

注意事项：

本质粒未经书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明：
1.首次使用1µg包装的本产品时，请先取少量本质粒转化大肠杆菌，进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定，或通过测序进行鉴定。
2.100µg包装的本产品质粒浓度为0.1µg/µl，共1ml。可以直接用于酶切或者转染细胞。