特别提示：包括副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测试剂盒在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测试剂盒
英文名称：Haemophilus parasuis Fluorescent qPCR Kit
产品货号：BTN11-160
产品规格：50次

本产品是基于PCR的HPS检测试剂盒。副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis, HPS)属巴斯德氏菌科嗜血杆菌属，是一种依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)且没有运动性的小型、多形性、革兰氏阴性杆菌。HPS 可引起猪多发性浆膜炎、关节炎，严重时导致体温升高、呼吸困难甚至死亡, 给养猪业带来巨大的经济损失。目前对HPS的诊断主要是细菌分离培养和PCR。HPS 培养需要NAD、马血清和5% CO2 环境，需24-36小时，还容易出现杂菌污染，因此PCR是目前诊断HPS zuì常用的方法。

产品特点：
1. 灵敏度高，分析灵敏度可以达到50拷贝/uL，远高于细菌培养法。
2. 特异性高，根据HPS的16S rDNA基因保守区设计引物，可扩增出强、中和弱毒力的各种HPS血清型，但不会误检猪链球菌2型、猪伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等常见无关细菌。
3. 一管封闭式，避免了PCR产物对后续PCR的污染。
4. 线性范围广，在10-107拷贝/uL的靶分子浓度范围内均呈线性。
5. 简单快捷，只需要2小时即可得到实验结果。

产品组成：

组分	规格(50T)
即用型荧光PCR Mix	750μl
HPS专一性引物对	100μl
HPS阳性对照	50μl
超纯水	1mL

保存条件：-20℃保存，有效期一年。

使用方法：

一、样品DNA的制备
用自选方法纯化HPS样品的DNA，也可以另购本公司的柱式细菌DNA提取试剂盒(BTN60802)，跟本试剂盒兼容。

二、制备HPS标准曲线
1. 标记6个离心管，分别为1,2,3,4,5和6号。
2. 用带芯分别加入45μl超纯水（zuì好用带芯枪头，下同）。
3. 在1号管中加入5μl HPS阳性对照(本试剂盒提供)，充分震荡1分钟。
4. 换枪头，从1号管中取5μl溶液到2号管中，充分震荡1分钟。
5. 换枪头，从2号管中取5μl溶液到3号管中，重复上面的操作直到得到6个稀释度的样品。
6. 从6个管中分别取5μl进行定量PCR（见下步），每个样品zuì好重复3次。

三、荧光定量PCR反应（30μl体系）
7. 在PCR管中加入下列成分（每个样品zuì好重复三次，这里只列出一次）：

成份	样品	6个阳性对照	阴性对照
HPS专一性引物对	2μl	2μl	2μl
样品DNA	5μl	无	无
HPS阳性对照	无	5μl	无
自备1×ROX (见注)	2μl	2μl	2μl
补超纯水到	15μl	15μl	15μl
即用型荧光PCR Mix	15μl	15μl	15μl

注：仅ABI7500、7700和7900仪器需要使用ROX作为对照，其他荧光PCR仪器（如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480）不需要使用ROX。此处阴性对照用的是水，用户也可以用其他大肠杆菌基因组DNA做阴性对照。
8. 轻柔混匀后上机，按下面参数进行定量PCR，反应参数如下：

过程	温度	时间	说明
预变性	95℃	5分钟
PCR反应 (40~50个循环)	95℃	20s	收集荧光数据， 所选择波长见注。
	62℃	20s
	68℃	20s
溶解曲线分析判断 产物特异性	加热到95℃ 10分钟，然后降低到55℃后，按0.5℃/10s的升幅将温 度提高到95℃，其间记录下荧光信号的变化。特异的HPS PCR扩增 产物将在84.5℃产生特异峰。

注：本产品所用荧光染料跟DNA结合时的zuì大光吸收是500 nm，zuì大发射波长是530 nm，不能DNA结合时zuì大吸收波长是471 nm，无发射。

四、数据处理
9. 以HPS阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。本试剂盒提供的阳性对照浓度为XXX拷贝/uL，所以1-6管中的稀释样品浓度可以由此计算出来。再用浓度的的log为横轴，以Ct值为纵轴，通过待测样品的Ct值反推出样品DNA的浓度。
10. 如果没有自己做标准曲线，可以用本试剂的经验标准曲线方程：
Ct=-3.4logX+25.4
用户将样品所测Ct值放入方程式即可计算出X（样品DNA浓度）。此法不是非常准确，因为仪器型号，试剂，操作误差等都会影响结果。

除了副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测试剂盒,，我公司还供应以下相关产品：



名称：阪崎肠杆菌单重荧光PCR检测试剂盒
货号：SYA001
规格：48次/盒
本试剂盒适合于增菌培养物、疑似病料及食品中阪崎肠杆菌(ESKZ)的检测。阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)是乳制品中近几年新发现的一种致病菌。它是存在自然环境中的一种“条件致病菌”，已被世界卫生组织和许多国家确定为引起婴幼儿死亡的重要条件致病菌，可导致任何年龄层人群的疾病，尤其是对早产儿、出生体重轻的婴儿或免疫受损婴儿的威胁zuì大，严重者可导致败血症、脑膜炎或坏死性小肠结肠炎。本方法为荧光PCR检测方法，反应在同一管内连续进行，操作简单，并有效防止了污染，能对样品中或预培养液中的阪崎肠杆菌进行快速检测，具有特异性高、敏感性强和操作简便的特点。

试剂盒组成：

组分	规格
荧光PCR反应液(ESKZ-qPCR MIX)	672μL
DNA抽提液(DNA Extraction )	2mL
酶混合物(DNA Polymerase MIX)	48μL
阴性对照(NTC)	50μL
阳性对照(ESKZ -PTC)	50μL

储存条件：-18℃以下，有效期6个月。

使用方法：

一、样品采集：
?食品样品：样品的采集与预培养按照样品的采集与预培养按照《食品卫生微生物学检验阪崎肠杆菌检验(GB/T 4789.40-2008)要求进行。
?血液样品：用无菌注射器抽取受检者静脉血2mL，注入无菌EDTA2Na(或柠檬酸钠)抗凝管，立即混匀。
?粪便样品：取粪便置于灭菌的收集管中送检。
?病灶部位样品：取发病部位新鲜渗出物、粘液脓血送检。
 注：上述样品建议经过增菌后，收集培养物用于检测。

二、DNA提取：
可采用PCR试剂盒配备的DNA抽提液，按以下说明进行DNA核酸的粗提。也可采购北京百奥莱博科技有限公司生产的DNA提取试剂盒(过柱法-荧光配套)或其他合适的商业化产品，并按照相应试剂盒说明进行操作。
?液体培养物：取液体培养物100μL加到1.5mL无菌离心管中，8000rpm离心3min，尽量吸弃上清，加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清5μL进行PCR反应。
?固体培养物：挑取单克隆菌落与50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min，取上清5μL进行PCR反应。
?粪便样品：挑取米粒大小粪便于灭菌离心管中，加入0.5mL生理盐水，振荡混匀，13000rpm离心3分钟，弃上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。
?其他液体标本：取标本2-3mL，13000rpm离心3min，弃上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混匀，100℃恒温10min，13000rpm离心3min取上清5μL进行PCR反应。
 注：阳性对照和阴性对照为已经抽提好的核酸(无需提取)，直接取5μL加入到反应体系中即可。由于阳性对照浓度较高，建议zuì后在样品制备区域加入阳性对照。

三、检测步骤：
1．试剂的准备
从试剂盒中取出荧光PCR反应液(ESKZ -qPCR MIX)、酶混合物(DNA Polymerase MIX)，室温融化并振荡混匀后，10000rpm离心10s。
设所需要的PCR反应管管数为N(N=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照)，每个测试反应体系配制如下表：

试剂	每个反应加入的量	N个反应加入的量
荧光PCR反应液	14 μL	N×14μL
酶混合物	1 μL	N×1 μL
总量	15 μL	N×15μL

计算好各试剂的使用量，加入一适当体积洁净离心管中，充分混匀，10000rpm离心10s，向设定的N个PCR反应管中分别加入15μL，向每管中加入处理后样品或阴性对照(NTC)和阳性对照(ESKZ -PTC)5μL，10000rpm瞬时离心10秒。
2．qPCR反应条件
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内。
推荐循环条件：

	1循环	50℃ for 2 min
预变性	1循环	95℃ for 10min
PCR扩增	40循环	95℃ for 15s 60℃ for 60s

在60℃延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM

四、结果分析：
1．结果分析条件设定
直接读取检测结果。基线和阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的zuì高点为准。
2．试验成立判定
?阴性对照(NTC)：不应产生任何的扩增曲线。
?阳性对照(ESKZ -PTC)：均产生扩增曲线，且Ct值≤35。
?以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效。
3．结果判定
?在试验成立的条件下，Ct值≤35的样本为阳性，表明阪崎肠杆菌核酸阳性。
?Ct值显示为无的样本为阴性样本，表明阪崎肠杆菌核酸阴性。
?如果35＜Ct值≤40，判为可疑样品。对于可疑样品，先看扩增曲线。如果扩增曲线为对数扩增曲线，则为可疑阳性，否则判为阴性。
?对于可疑阳性样品，重新抽提核酸，再次进行阪崎肠杆菌real time PCR检测。如果重复扩增曲线为对数扩增曲线，判为样本阳性，表明阪崎肠杆菌核酸阳性；否则判为样本阴性。

五、注意事项：
?初次使用前请仔细阅读说明书。并严格按照说明书步骤操作。
?所有使用的离心管应高压灭菌，而且必须不含DNA酶。
?PCR操作应严格按照要求分区(试剂配制区、标本处理区、PCR扩增区等)，防止实验室污染。
?样本提取、试剂配置、加样需在不同区的超净工作台进行，以免污染。
?试剂盒里所有物品应视为污染物对待，按照卫生部《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。