| 数量 | 现货 |
| 供应商 | 上海研卉生物科技有限公司 |
| 规格 | 100/200次 |
细菌RNA提取试剂盒使用说明
| 产品及特点 | 本产品是在动物RNAout基础上根据细菌提取的具体情况改良而得。它基于异硫氰酸胍/酚/氯仿提取RNA原理,可用于包括E.coli、Bacillus subtilis和Staphylococcus aureus等各种常见的革氏阴性和阳性细菌。 操作简单快速，只要十分钟左右,可以全在室温下进行。 所得RNA质量高,OD260/OD280一般在1.9，不含基因DNA污染。 灵敏度高，可以从一个菌落中提取到普通电泳能够检测到的总RNA。 性价比高于进口同类产品。 | |||||||||
| 规格及成分 |
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| 运输及保存 | 常温运输，4℃保存，有效期一年。 | |||||||||
| 自备试剂 | 氯仿，异丙醇，75%乙醇，RNA溶解液 | |||||||||
| 使用方法 | 在1.5 mL塑料离心管中离心收集0.2-1.5 mL新鲜细菌（注意:由于细菌RNA半衰期十分短，所以，必须使用最新鲜细菌），吸尽液体培养基，加入1 mL细菌RNAOUT并用枪充分吹打，确保细菌全部裂解，没有块状物。如果使用菌落，则用接种环小心将其转移到装有1 mL细菌RNAOUT的1.5 m塑料离心管中，用移液枪吹打均匀。在细菌数较少时，建议使用助沉剂RNADOWN以提高RNA回收率。 加入0.2 mL氯仿，在振荡器上充分振荡混均30秒（必须将管底的液体振荡起来，否则不能有效将DNA打断和去除蛋白质）。 12000-15000 g室温离心3分钟。上清液无色，下层液呈篮色，中间为蛋白质。小心将上清液转移到另一干净1.5 m塑料离心管中，上清液体积约为0.6 mL。为避免触及中间层的DNA和蛋白质，建议分小量多次吸取，并且只取0.5 mL，留0.1 mL左右。当细菌数量较少时，中间层十分松散，上清时很容易吸到下层有机相，需要更加小心。 在上清液中加入等体积的异丙醇，振荡器上振荡混均30秒。 12000-15000室温离心3-10分钟，RNA将在管底侧面形成沉淀。 小心吸弃上清液，注意不要吸弃RNA沉淀。 在离心管中加入1mL 75%乙醇，振荡器上振荡混均30秒。 12000-15000 g室温离心1分钟。 小心吸弃上清液，注意不要吸弃RNA沉淀。 重复第8到第10步一次。 短暂快速离心，用移液枪小心吸弃残留液（约50 μL）。 短暂放1-2分钟后加入适量RNA溶解液使RNA沉淀溶解，可以立即使用或存放于-80℃长期保存。 RNA完整性的电泳检测： 如果需要做Northern杂交，强烈建议用户使用甲醛变性胶进行RNA电泳，因为非变性胶不能分离所有的RNA分子（BioTechniques，28：414，2000）。如果是简单检测，可以使用TAE或SuperBuffer-2 DNA/RNA两用快速电泳液，但文献报道必须使用变性上样液（BioTechniques，9：558，1990）。普通DNA上样液不含变性剂，也没经过去RNase处理，所以最好不要使用。 尤其需要注意的是不要使用TBE进行RNA电泳，因为TBE所含硼酸是研究多糖的经典方法----硼酸络合法中的关键成分，硼酸通过与RNA核糖中的羟基发生络合反应，形成RNA分子内或RNA分子间的络合复合物，使同样长度的RNA具有不同的泳动速度，电泳条带弥散，同时有大的RNA络合复合物迟留在加样孔中（一般会误以为是基因组DNA污染）。RNA分子内或RNA分子间的络合物的形成的多少和比例又与硼酸与RNA的数量比例有关，而RNA样品中污染的其他多糖（如植物中提取的RNA）也会参与此反应，使硼酸对RNA电泳的影响更复杂，所以TBE对RNA电泳的影响没有规律性和重复性。有的样品可以使用有的又不行，最好是避免使用。 由于细菌细胞中70-80%的RNA为rRNA，后者又由23S （约3700 nt），16S （约1700 nt）和5S （约100 nt）三种组成，所以变性胶电泳后应该在UV下看见三条清晰的rRNA带。由于核酸长度与结合EB的数量成正比（当然还与RNA的二级结构有关，双链部分结合能力比单链部分强），所以23S rRNA条带的荧光强度一般比16S rRNA条带的荧光强度强2倍。如果这两条rRNA带不清晰或比例小于此范围则表示RNA有降解（因为大的RNA被酶降解的可能更大）。 RNA产量产率测定： 将5-10 μL RNA溶于TE缓冲液中（pH7.5-8.2之间）检测其在OD260的光吸收。通过光吸收可以得出RNA浓度（1 OD260的RNA=40 μg/mL），进而计算出RNA的产量和产率。 注意不要将RNA稀释在DEPC水中检测OD260和OD280，否则光吸收比在TE中测得的低10%-15%，因为核酸光吸收跟溶液pH相关，而DEPC水中的DEPC高压分解后产生的CO2 与水反应生成碳酸，使溶液pH降低进而降低RNA的光吸收。 RNA纯度测定： 无污染的总RNA的OD260/OD280一般在1.8-2.1之间（具体数值与其碱基组成和溶液成分等多种因素有关），OD260/OD230一般在2.0-2.3之间，如果低于或高于此范围则分别表示样品可能有蛋白质或多糖的污染，但一般不影响RT-PCR等反应。蛋白质污染可以通过酚/氯仿抽提一次然后酒精沉淀去除，DNA和多糖污染可以分别用DNA Erasol 和PS Erasol去除。 | |||||||||
| 疑难解答 | Q：上样孔里的红色荧光物一定是污染的基因组DNA吗？ A：不是。用TAE或TBE电泳液和非变性胶电泳RNA时容易产生此现象，初步研究发现大部分红色荧光物是变性不充分的单链RNA通过碱基互补或通过硼酸络合（如果使用TBE作电泳液的话）形成的复合物，加RNase处理后，这些红色荧光物一般会消失。为避免此现象，建议最好使用甲醛变性胶电泳。如果需要使用非变性胶，也必须在上样前使RNA变性。使用上样/变性/染色三用溶液RNAON可以使RNA在非变性胶上电泳时也有较好分辨率。使用非变性胶时，可以使用TAE或超快电泳液SuperBuffer-2，最好不要使用TBE缓冲液，因为TBE中的硼酸能与RNA的多羟基形成复合物，RNA很难形成锐利的条带。 Q：如何确认和去处除污染的基因组DNA？ A：如果怀疑有DNA污染，可以用RNase处理RNA样品，然后再电泳。如果上样孔里的红色荧光物不消失，则表示是基因组DNA污染。进一步确认可以使用PCR扩增法。去除污染的DNA可以使用非酶的DNA去除剂DNA Erasol或RNase-free DNase，由于RNase-free DNase一般都有残留的RNase污染，所以必须严格按照厂家提供的使用手册进行操作。 |
