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- GST pulldown分子互作实验服务生物实验动物实验整体课题外包代做
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2021-09-10 14:06
我要认领哈尔滨中科赛恩斯生物技术有限公司
樊勇
Scientia@hrbsci.com
产品属性
产品说明
实验原理
GST pull-down将靶蛋与GST融合表达，并将蛋白固化在谷胱甘肽(GSH)亲和树脂上，作为与目的蛋白亲和的支撑物，充当“诱饵蛋白”，目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白) ，洗脱结合物后通过电泳分析，从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白。
GST pull-down融合蛋白沉降技术，利用基因重组将带有GST标签的载体插入到目标蛋白A上，谷胱甘肽包裹的磁珠与目标融合蛋白结合，加入细胞裂解液后，具有相互作用的蛋白被融合蛋白吸附，加入过量的谷胱甘肽进行洗脱，洗脱后通过质谱分析法对样品进行分析鉴定。
GST pull-down融合蛋白沉降技术蛋白相互作用分析主要是研究体外强烈或者稳定的蛋白质间相互作用；可以鉴定两种已知的感兴趣蛋白质可能存在的直接相互作用；寻找可能与目标蛋白存在相互作用关系的未知蛋白。通过高通量方法洗脱并对结合的蛋白质进行质谱鉴定。实验流程
- 活化冻存菌种 GST 和 GST-X ，按比例将表达蛋白的冻存菌液过夜培养。以预实验确定的最佳 IPTG 浓度、时间和温度诱导表达靶蛋白。诱导适当时间后，离心 弃上清。1 0ml 菌液沉淀用 1 ml PBS 重悬至悬液透明离心上清转移至新的离心管，加 DTT 至终浓度 1mmol/L。
- 轻轻颠倒树脂盛装容器，混成匀浆。取适量匀浆放入离心管中，离心 5min 后弃上清。初始匀浆加入预冷的 PBS ，颠倒混匀后，离心弃上清，制成 50% 匀浆，颠倒混匀置冰上放置待用。上清与适量 50% 谷胱甘肽 - 琼脂糖树脂匀浆混合， 轻摇后离心弃上清。沉淀加入 10 倍床柱体积 PBS ，颠倒混匀以洗去未与树脂结合的杂蛋白。重复步骤三次。
- 将细胞裂解液与 50ul 的和 GST 结合的 50% 谷胱甘肽 - 琼脂糖树脂悬液翻转混合孵育 2h 。 离心将上清转移到新的离心管中。设定两个等量预清除的细胞裂解液，分别加入到结合 GST 和 GST-X 蛋白的 谷胱甘肽 - 琼脂糖树脂中，翻转混合孵育 2h 。离心后用冰冷的细胞裂解液洗涤，弃上清，重复洗三次。加入 50ul 的 2*Loading Buffer 。轻弹混匀，沸水煮 5~10min ，离心后收集上清。
合作流程
- 咨询客服，提供实验方法、内容以及相关实验要求，项目员、技术员对实验项目进行可行性评估。
- 出具项目报价，签订实验服务合同，双方保密协议，出具详细实验方案，客户寄送实验样本和实验试剂，
- 技术员根据实验方案开展预实验，网站个人中心实时更新实验进度，实验完成出具详细实验报告。
实验须知
- 中科赛恩斯生物坚决秉承“严肃严谨、死磕真实、拒绝造假、绝对保密”的科学服务精神，以及严格的契约精神，为您提供优质实验服务。
- 根据客户实验预期效果，进行一定的实验文献检索，重要步骤均使用知名品牌试剂/设备进行每一步的操作质控。
- 严谨的预实验设置，根据说明要求设置参照样本，用2-3种方式进行实验，为正式实验提供最佳实验条件。
- 使用GraphPad 软件作图，并标记显著性，提供.pzf源始文件。分析数据的原始Al文件和导出的.tif图片，提供完整的实验报告（含：实验分组、实验结果、实验结论、实验步骤）。
