Lonto® ELISA
仅供科研使用，不得用于临床诊断人单纯疱疹病毒I型IgM抗体（HSV-1 IgM Ab）定量检测试剂盒（ELISA）货号：CR-006
定量检测人血清、血浆、细胞培养上清液中单纯疱疹病毒I型IgM抗体（HSV-1 IgM Ab）的浓度。
使用试剂盒前，必须仔细阅读本说明书。
中国 | 泉州市蓝图生物科技有限公司
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简介单纯疱疹病毒属于疱疹病毒科a亚科，呈球形，完整病毒由核心、衣壳、被摸及囊膜组成。核心含双股DNA，缠绕成纤丝卷轴，衣壳呈十二面体对称，由162个壳微粒组成，直径为100nm。衣壳外被一层被膜覆盖，厚薄不均，最外层为典型的脂层双层囊膜，上有突起，囊膜表面含（gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL、gM）糖蛋白，其中gB和gD与病毒吸附和穿入有关，是与细胞特异性受体相互作用的病毒配体分子。gD诱导产生中和抗体的能力最强，可用于研制疫苗。gC是补体C3b―结合蛋白（complement C3b-binding protein）。gE是Fc受体，可与IgG的Fc端结合。gG为型特异性抗原，gH与病毒的释放有关。
单纯疱疹病毒(HSV)有两个血清型即单纯疱疹病毒l型(HSV-1)和单纯疱疹病毒2型(HSV-2)，两型病毒核苷酸序列有50％同源性。HSV-l主要是通过呼吸道、皮肤和粘膜密切接触传播，十岁以前的儿童最易受到感染，有症状的感染主要是引起疱疹性口腔炎、疱疹性角膜炎、疱疹性脑炎等。HSV-2主要通过性传播，可引起生殖器疱疹，85％以上的生殖器疱疹是由HSV-2引起，HSV-1一般不引起生殖器的复发性感染，99％以上的复发性生殖器疱疹由HSV-2引起。
孕妇由于体内激素水平的变化，及免疫低下，易受单纯疱疹病毒感染，妊娠期感染不仅危害母体，往往可引起宫内感染而导致流产、早产、死胎。HSV的快速诊断对于确保选择性抗病毒化学疗法的早期应用以及减小感染传播都是非常必要的。第一个由体液引起的对感染的免疫反应是特异性抗HSV IgM抗体综合体，它可以在被感染后一周内检测出来．通常这是新感染或感染痊愈的一个证据。特异性IgM抗体通常在感染后的2-3周出现，但在一个月后会减少。而IgG长期存在，该检测是对病人免疫状态进行估计，并提供对于HSV的血清学辅助检测。
实验原理本试剂盒采用双位点夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）。在预包被人单纯疱疹病毒I型（HSV-1）抗原（固相抗原）的微孔酶标板中，加入人单纯疱疹病毒I型IgM抗体（HSV-1 IgM Ab）校准品和待测样本，再加入另一株HRP标记的人免疫球蛋白M（IgM）抗体（酶标抗体），经过温育与充分洗涤，去除未结合的组分，在微孔板固相表面形成固相抗体-抗原-酶标抗体的夹心复合物。加底物A和B，底物在HRP催化下，产生蓝色产物，在终止液（2M 硫酸）作用下，最终转化为黄色，在酶标仪上测定吸光度（OD值），吸光度（OD值）与待测样品中单纯疱疹病毒I型IgM抗体（HSV-1 IgM Ab）的浓度正相关。拟合校准品曲线，可以计算出样本中单纯疱疹病毒I型IgM抗体（HSV-1 IgM Ab）的浓度。
试剂盒限制性1、仅供科研使用，不得用于临床诊断。
2、在试剂盒标示的有效期内使用，过期产品不得使用。
3、跟其他厂家的试剂盒或者组分不能混用。
4、使用试剂盒配套的样品稀释液。
5、如果样本值高于最高标准品浓度值，请将样本适当稀释后，再重新测定。
6、待测样本中存在的人抗鼠等异嗜抗体会干扰检测结果，检测前，请排出该因素。
7、通过其他方法得到的检测结果，与本试剂盒测定结果不具有直接的可比性。
技术提示1、混合蛋白溶液时，避免起泡。
2、加校准品与样本时，每个校准品浓度和样本都要更换移液枪头，公共组分应该悬臂加样，避免交叉污染。
3、合适的温育时间，和充分的洗涤步骤，是保证实验结果准确性的必要条件。
4、使用自动洗板机时，加入一个30秒浸泡的步骤，可以提高检测精度。
5、底物溶液为无色液体，保存过程中变为蓝色，代表底物溶液已经失效，不得使用。
6、终止液加样顺序与底物溶液加样顺序一致，加入终止液后，蓝色底物产物，会瞬间变为黄色。
7、实验中，用剩的板条，应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
8、所有液体组分，使用前充分摇匀，严格按照说明书标明的时间、加样量及加样顺序进行温育操作。
试剂盒组分与保存未开封的试剂盒保存在2-8度，不得使用过期试剂盒。
| 组分 | 数量 | 主要成分 | 开封后储存 |
| 校准品 | 0.5ml/管 | ****** | 2-8℃1天 |
| 包被微孔板 | 96T | 预包被固相抗原 | 2-8℃14天 |
| HRP标记抗体 | 6mL | HRP标记的检测抗体 | 2-8℃180天 |
| 底物液A | 6mL | 0.01%过氧化氢 | 2-8℃180天 |
| 底物液B | 6mL | 0.1%鲁米诺 | 2-8℃180天 |
| 30×浓缩洗涤液 | 20mL | 0.05%Tween20 | 2-8℃180天 |
| 说明书 | 1份 | -- | -- |
| 自封袋 | 1个 | -- | -- |
| 不干胶 | 2片 | -- | -- |
其他用品1、酶标仪
2、精密移液器及一次性吸头
3、蒸馏水
4、洗瓶或者自动洗板机
5、37℃水浴锅或恒温箱
6、500ml量筒
7、质控品（可从蓝图生物科技产品研发系统中选择）
生物安全1、检测必须符合实验室管理规范的规定，严格防止交叉污染，所有样品、洗弃液和各种废弃物都应按照传染物进行处置。
2、试剂盒的液体组分中，含有proclin-300防腐剂，可能引起皮肤过敏反应，避免吸入烟雾与皮肤接触。
3、底物液对皮肤、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入烟雾。
4、戴上防护手套，实验完成后彻底洗手。
样品的采集和储存以下只是列出样品采集和保存的一般指南。所有样本采集保存过程中，不得使用叠氮钠做为防腐剂。
1、
细胞培养上清：4000rpm条件下离心20min，去除细胞颗粒和聚合物，上清液保存在- 20℃以下，避免反复冻融。
2、
血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，4000rpm条件下离心20min，小心地分离出血清，保存在- 20℃以下，避免反复冻融。
3、
血浆：肝素，EDTA，或柠檬酸钠作为抗凝剂。在4000rpm条件下，离心20分钟取上清，血浆保存在-20℃以下，避免反复冻融。
样本收集后，不是一次检测完，请按一次用量分装冻存，避免反复冻融，使用时在室温下解冻，确保样品均匀充分解冻。
试剂准备1、使用前，所有的组分都要至少复温30min，确保充分复温到室温。
2、浓缩洗涤液：从冰箱取出的浓缩洗涤液，会有结晶产生，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解。浓缩洗涤液与蒸馏水，按1:30稀释，即1份的浓缩洗涤液，添加29份的蒸馏水。
3、底物：底物液A和B，在使用前，按1:1体积充分混合，混合后15分钟内使用。
操作程序所有试剂和组分都先恢复到室温，标准品、质控品和样品，建议做复孔。
1、按前面说明书描述的方法，配制好试剂盒各种组分的工作液。
2、从铝箔袋中取出所需板条，剩余的板条用自封袋密封放回冰箱。
3、设置标准品孔、样本孔和空白孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。
4、样本孔加待测样本50μL。
5、除空白孔外，标准品孔和样本孔，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体50μL。
6、用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱温育120min。
7、揭开封板膜，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复5次。若使用自动洗板机，请按洗板机操作程序进行洗板，添加浸泡30s的程序，可以提高检测的精度。洗板结束，加底物前，要在干净不掉屑的纸上，充分拍干反应板。
8、将底物A和B按1:1体积充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱温育15min。
9、所有孔加入终止液50μL，在酶标仪上读取各孔吸光度（OD值）。
结果计算以标准品浓度做为纵坐标，对应的吸光度（OD值）作为横坐标，利用计算机软件，采用四参数Logistic曲线拟合（4-pl），创建标准曲线方程，通过样本的吸光度（OD值），利用方程计算样品的浓度值。
如果样品被稀释，通过上述方法测的的浓度值，要乘以稀释倍数，才是样品的最终浓度。
试剂盒性能指标1、物理性能试剂盒的各液体组分应澄清透明、无沉淀或者絮状物。微孔板铝箔袋应真空包装，无破损漏气。
2、剂量反应曲线线性校准品剂量反应曲线相关系数r值，大于等于0.9900。
3、精密度批内精密度：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在同一个板块内精度评估。批内变异系数CV%小于10%。
批间精密度：三组已知的高、中、低浓度样品，进行二十次在不同板块内精度评估。批间变异系数CV%小于15%。
4、灵敏度最低检出剂量小于******。
5、回收率三组已知的高、中、低浓度样品，进行五次在同一个板块内回收率评估，回收率在85%-115%之间。
6、样本值1524例健康志愿者血清和血浆样品进行测定，所有的样品测量小于****。
7、特异性本试剂盒识别天然和重组单纯疱疹病毒I型IgM抗体（HSV-1 IgM Ab），与结构类似物无交叉。
8、稳定性 2℃-8℃保存，有效期6个月。
