特别提示：包括SNP基因分型PCR试剂（探针法)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

产品名称：SNP基因分型PCR试剂（探针法)
英文名称：BaiExact Genotyping qPCR PreMix（Probe)
产品货号：WH0109
产品规格：125次|500次

本制品是一款专门应用于探针法SNP检测的即用型2×浓度的热启动PCR预混试剂。该预混试剂含有特异的抗体修饰Taq DNA聚合酶，能有效检测极低丰度的DNA模板。精心配制的独特PCR缓冲液能有效消除众多PCR抑制剂对PCR的抑制及对荧光信号淬灭的影响，对SNP鉴定有很好的特异性和扩增效率。

产品特点：
1．防弹式基因分型---轻松屏蔽PCR抑制剂对SNP分型的影响。
2．快速反应----对多数实验能够执行快速PCR操作。
3．荧光信号强----强劲的SNP分型仅需少量的引物探针。
4．避免操作失误----添加蓝色指示染料，监控实验添加过程。

试剂盒原理：
本制品适用于水解探针法进行模板的荧光定量PCR和SNP检测，该产品可以克服PCR反应液中的抑制因子，特别是对粗提样本，其表现出高度的抗逆性。适用于植物，动物，以及一些环境样本的粗提液。

2×BaiExact Genotyping PreMix（Probe)中特异的抗体修饰热启动Taq DNA聚合酶，95℃条件下仅需2~5分钟即可激活全部酶活，减少了反应时间，同时极大限度的减少PCR扩增全程中的非特异性扩增，配合精心优化的buffer体系，使该产品对于序列变异的鉴定有很好的特异性和扩增效率。

2×BaiExact Genotyping PreMix（Probe)包含dNTPs，增强剂，稳定剂等以提高产物特异性和反应灵敏度，并包含一种微蓝色的指示染料，该染料对PCR反应以及探针荧光没有任何影响；使操作更加方便，避免大量样本小体系（10μl体系）操作过程中容易产生的加样错误。

试剂盒组成：

组分	20μl×125次	20μl×500次
2× BaiExact Genotyping PreMix（Probe)	1.25ml	4×1.25ml
50×ROX Reference Dye	250 μl	1ml
RNase-Free ddH2O	2×1ml	5×1ml

储存条件：收到本产品后，请立即置于-20℃避光保存，在该条件下避光可保存2年。从-20℃取出使用时，将冻存的2× BaiExact Genotyping qPCR PreMix（Probe)和50×ROX Reference Dye溶解，然后轻轻颠倒混匀，待溶液完全均一后再行使用。如解冻后没有使用，须彻底混匀后重新冷冻（在解冻过程中盐会出现分层现象，未混匀进行冷冻，盐晶体的析出将会对酶造成损害)。如需一段时间内经常取用，可在2～8℃条件下储存3个月。避免反复多次冻融。

注意事项：请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
1．如果试剂没有混匀，其反应性能会有所下降。使用时请上下颠倒轻轻混匀，请不要使用振荡器进行混匀，尽量避免出现泡沫，并经瞬时离心后使用。
2．本产品中不含有荧光探针。
3．引物终浓度为300 nM，探针终浓度为200 nM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。需要进一步优化引物浓度的，可以在100-900 nM范围内调整；需要进一步优化探针浓度的，可以在100-250 nM范围内调整。
4．20 μl反应体系中，基因组DNA模板的使用量一般小于100ng。

操作步骤：

一、建立Real-Time PCR反应体系：
1．溶解2× BaiExact Genotyping PreMix （如果保存在-20℃)，50×ROX Reference Dye，模板，引物、探针和RNase-Free ddH2O，并将所有试剂在室温下平衡并彻底混匀。
2.建议置于冰上进行Real-Time PCR反应液的配制。反应体系如下：

成分	使用量（20μl体系)	终浓度
2× BaiExact Genotyping PreMix（Probe)	10μl	1×
正向引物（10μM）①	0.6μl	0.1～0.9μM
反向引物（10μM）①	0.6μl	0.1～0.9μM
探针（10μM）②	0.4μl	0.1～0.25μM
模板	2μl	-
50×ROX Reference Dye③	-	-
RNase-Free ddH2O	至20μl	-

①引物终浓度为0.3 μM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。扩增效率不高时，可增加PCR反应体系中的引物浓度；发生非特异扩增时，可适当减少PCR反应体系中的引物浓度。需要进一步优化引物浓度的，可以在0.1-0.9 μM范围内调整。
②探针的浓度与使用的Real-Time PCR扩增仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，实际使用时请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用说明进行。通常探针终浓度为0.2 μM可以在大多数体系中获得良好的扩增结果。需要进一步优化探针浓度的，可以在0.1-0.25 μM范围内调整。
③几种常见仪器的zuì适ROX Reference Dye浓度如下：
ABI PRISM 7000/7300/7700/7900HT/Step One等：5×（例如：5μl ROX/50μl体系)；
ABI 7500、7500 Fast；Stratagene Mx3000P、Mx3005P和Mx4000等：1×（例如：1μl ROX/50μl体系)；
Roche仪器，Bio-Rad仪器，Eppendorf仪器等：无需添加。
3.盖上反应管，轻柔混匀。可短暂离心，确保所有组分均在管底。
4.将反应体系置于荧光定量PCR仪中，开始反应。

二、进行Real time PCR反应：
建议采用两步法PCR反应程序进行反应；若模板量较低等因素导致扩增效果不佳，可使用三步法程序进行PCR反应。

两步法反应程序：

阶段	循环	温度	时间	内容	荧光信号采集
预变性	1×	95℃	2min④	预变性	否
PCR反应	40×	95℃	15sec	变性	否
		60℃	30sec⑤	退火/延伸	是

三步法反应程序：

阶段	循环	温度	时间	内容	荧光信号采集
预变性	1×	95℃	5min④	预变性	否
PCR反应	40×	95℃	15sec	变性	否
		50-60℃	15sec	退火	否
		72℃	30sec⑤	延伸	是

④解链时间的长短与模板的长度和GC含量有关。
⑤使用不同型号仪器进行时间设定时，请按照仪器使用说明书要求进行实验操作，几种常见仪器的时间设定见下表：
使用Roche，ABI 7500 Fast，BioRad和Agilent等公司荧光定量PCR仪时请设定在15sec。
使用ABI 7900HT/7900HT Fast/ViiA 7/StepOne/StepOnePlus时请设定在20 sec。
使用ABI 7000和7300时请设定在31 sec。
使用ABI7500时请设定在32 sec。

常见问题：

1．低浓度模板时扩增曲线混乱，荧光强度变弱

原因	解决办法
目标DNA的拷贝数过少	反应液中的目标DNA拷贝数只有几倍到几十倍时，拷贝数散乱的概率变大，容易形成线性混乱。请适当提高样品浓度再进行反应。
与引物二聚体发生竞争	目的片段扩增的同时出现引物二聚体的扩增，由于竞争使目的片段的扩增反应变弱。请摸索反应条件或重新设计引物，以防止引物二聚体的形成。
DNA被反应离心管吸附而损失	模板浓度较低或样品稀释后长时间存放时，会导致DNA被反应离心管吸附而损失。请提高样品浓度再进行反应。如果对样品进行稀释，建议稀释后立即进行反应。

2．重现性差

原因	解决办法
仪器方面的故障	因为仪器的不适用，在温度管理或检测时产生重现性差。请根据相应仪器的说明书进行点检。
样品纯度不好	不纯的样品会导致实验的重现性差。
稀释的模板放置太久	浓度较低的DNA溶液存放时间较长时，由于被管壁吸附从而实际浓度会更低，建议从原液重新稀释后再进行反应。另外，通过梯度稀释的标准样品zuì好每次使用时直接从原液稀释。
引物或探针质量下降	尽量避免新合成引物批次间的差异，可以使用原来质量好的引物做为对照。
PCR反应条件、引物浓度、序列等不恰当	扩增效率差的PCR较容易产生重现性差。通过变更引物和探针的浓度或PCR反应条件来进行调整。扩增不好时，一般可降低退火温度或提高引物浓度，也可以延长延伸时间。如模板的GC含量较高，可延长变性时间。仍得不到改善时，建议重新设计引物和探针。
计量误差	反应体积太小会导致检测精度下降。请根据定量PCR仪推荐的反应体积重新实验。

3．NTC可见扩增

原因	解决办法
发生交叉污染	请更换新的试剂或灭菌水。仍无法得到改善时，请尝试到新的实验环境进行操作。
仪器设定误差（多重PCR）	当使用几种荧光探针时，请正确设定荧光测定，防止出现因不同染料的光谱交叉而导致的检测信号差异。

4．扩增曲线荧光信号很弱，或扩增曲线呈锯齿状

原因	解决办法
检测光光谱设定误差	由于目前不同荧光定量PCR仪的原理和提供的检测光光谱范围的差异，因此在选择探针的发光基团和淬灭基团时一定要根据所用的仪器型号设置的可检测的荧光信号范围内选择。请参照仪器的使用说明书，重新确定参数设置。
荧光探针纯度太低	请使用HPLC级别以上纯化的Probe，否则残留的未结合的荧光染料会造成基线上飘，从而导致扩增产物所产生的荧光值变低。
荧光探针质量较差	由于探针保存中分解导致基线上飘，从而导致扩增产物所产生的荧光值变低。此外，一部分荧光染料不适合含有EDTA的buffer进行保存。请按照Probe合成公司推荐的保存条件。
荧光采集时间太短	对部分仪器，需要更长的延伸时间来充分采集荧光。扩增曲线锯齿状较明显时，将延伸时间设定为45-60 sec可得到改善。

除了SNP基因分型PCR试剂（探针法),，我公司还供应以下相关产品：



名称：DMSO，PCR级
货号：BTN80205
规格：1.5mL
大量实验显示5-10%的DMSO能够促进PCR反应，尤其是高GC模板的PCR反应，本产品就是专门用于PCR或RT-PCR的高纯度DMSO。

储存条件：常温运输及保存，有效期一年。

名称：6nt随机引物(0.5 ug/uL)
货号：BTN100409
规格：5μg
本产品为长度为6nt的随机引物，序列为5´-(NNNNNN)-3´，主要用于以任何RNA为模板合成cDNA，也可以用于DNA探针的随机引物标计。

储存条件：低温运输和-20℃保存，有效期一年。

疑难解答：
Q：在合成cDNA时，使用Oligo dT12-18和用随机引物有何区别？
A：只有当以带polyA尾巴的RNA作为模板才能使用Oligo dT作为引物，而任何RNA模板都可以使用随机引物。使用后者的序列覆盖率比使用Oligo dT更高。

名称：全血Taq DNA聚合酶
货号：WE0127
规格：2500U
本品是通过缺失Taq DNA Polymerase N端一段氨基酸和突变改造得到的新型DNA聚合酶。通过改造后使本产品能够全血中存在的抑制剂产生耐受作用，能够直接扩增人和小鼠全血样品中的DNA而无需事先对基因组进行提取和纯化。PCR产物3’端为A，可直接用于T/A克隆。

产品组成：

组份	2500U
BloodTaq DNA Polymerase，5 U/μl	5×100μl
BloodTaq PCR Buffer, 10×	5×1.8ml

注意： BloodTaq PCR Buffer含有30 mM MgCl2

质量控制：
1、经过多次柱纯化，SDS-PAGE检测其纯度大于99%；
2、经检测无外源核酸酶活性；
3、PCR方法检测无宿主残余DNA；
4、能有效地扩增人基因组中的单拷贝基因；
5、室温存放一周，无明显活性改变。

使用方法：
1、使用前请将BloodTaq DNA Polymerase反复颠倒至完全混匀。
2、将PCR薄壁管置于冰上，加入除全血外的以下试剂。

试剂	50μl反应体系	终浓度
BloodTaq DNA Polymerase	1μl
BloodTaq PCR Buffer, 10×	5μl	1×
dNTP Mix，2.5 mM each	4μl	200μM each
Forward Primer(10μM)	2μl	0.4μM
Reverse Primer(10μM)	2μl	0.4μM
全血	≤10%
RNase-Free water	xμl
Total	50μl

注意：
a.加入全血前反复上下吸打完全混匀各种试剂、
b.DNA模板：可以使用肝素钠、Na-EDTA、K-EDTA或柠檬酸钠处理全血。通常建议全血含量为5-10%。不推荐使用高浓度血液。对于高GC含量的模板，加入10%DMSO。
c.引物：寡核苷酸引物长度通常含20-30个核苷酸，并且zuì好GC含量在40-60%并均匀分布于引物中。在常规的PCR反应中，引物浓度请以终浓度0.1-1.0μM作为设定范围的参考。

3、zuì后将全血加入管底。
4、PCR反应条件

步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	5 min
变性	95℃	30 s	35-40 个循环
退火	50-68℃	30 s
延伸	72℃	250-500 bp/min
终延伸	72℃	10 min

注意：
a.PCR仪于94-95℃预热，将样品放置于PCR仪上开始循环。
b.BloodTaq提高了冷敏感性，具备了一些热启动特性。通常可以通过在冰上配制反应成分、zuì后加入聚合酶以及将热循环仪预热至变性温度(95℃)后立即进行反应来避免非特异性产物的产生。
c.变性温度与时间：在PCR循环前为了充分裂解血液细胞和释放/变性DNA，要求初始变性为95℃ 5分钟。
d.退火温度与时间:退火时间通常为30秒-1分钟。退火温度可以低于理论退火温度(Tm)5℃开始，通过梯度PCR进行优化。
e.延伸时间：延伸反应通常在72℃下进行。一般每250-500 bp延伸时间为1分钟。推荐72℃ 10分钟进行zuì终延伸。
f.通常35-40个循环可以达到zuì优扩增。

5、结果检测：反应结束后取5μl反应产物并加上电泳缓冲液一起电泳检测结果。

储存条件：-20℃，避免反复冻融。