| 数量 | 大量 |
| 英文名 | 酵母质粒DNA小量提取试剂盒 |
| 保质期 | -20℃保存2年 |
| 供应商 | 上海泽叶生物科技有限公司 |
| 保存条件 | -20℃ |
| 规格 | 盒 |
产品组分
货号 | ZY1061 （50次） | ZY1062 （100次） | ZY1063 （200次） |
RNaseA | 150 μl | 300 μl | 600 μl |
溶液YⅠ | 15 ml | 30 ml | 60 ml |
溶液YⅡ | 15 ml | 30 ml | 60 ml |
溶液YⅢ | 20 ml | 40 ml | 80 ml |
溶液PB | 30 ml | 50 ml | 100 ml |
溶液W | 30 ml | 30 ml×2 | 40 ml×3 |
溶液Eluent | 5 ml | 10 ml | 20 ml |
DNA纯化柱 | 50个 | 100个 | 200个 |
说明书 | 1份 | 1份 | 1份 |
● RNase A的浓度为10 mg/ml。
● 溶液W初次使用前用无水乙醇按1: 1.5稀释，即含60%乙醇。
● 溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、溶液PB中含有碱及蛋白变性剂，请不要直
接接触皮肤。
● 上述产品组分均可单独购买，详见产品索引。
● 本试剂盒需单独购买试剂：溶壁酶（N9031/N9032）。
产品说明
本产品采用了经典的硅胶膜及碱裂法技术，用于酵母质粒DNA小量纯化。纯化原理是用溶壁酶消化酵母细胞的细胞壁，碱裂解酵母细胞后，硅胶膜柱高效可逆地吸附体系中的质粒DNA（高盐、低pH值），蛋白及其它杂质不被吸附而被除去，被吸附的DNA在低盐、高pH值条件下再被洗脱纯化。一次可从1-5 ml（不超过5×107个）的过夜培养的酵母菌液中纯化高纯度质粒DNA（OD260/280 = 1.7-1.9），此质粒DNA可直接用于DNA序列分析以及各种酶促反应等。
质量控制
从酵母中提取pBI121质粒DNA。提取的质粒DNA质量通过琼脂糖凝胶电泳、限制性酶切和序列测定分析。
保存条件
RNase A：可室温保存1年以上，低温可长期保存。RNase A为浑浊溶液。初次使用本试剂盒时，请将RNase A全部加入到溶液Ⅰ中，均匀混合后于4℃保存。可保存6个月。
其他试剂：室温保存。
若溶液Ⅱ出现沉淀，请于37℃保温溶解。待恢复至室温后使用。沉淀的出现不会影响质粒DNA的纯化结果。
注意事项--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
● 溶壁酶（N9031/N9032）需要客户另行购买。
● 通常酵母质粒拷贝数都很低，一般通过电泳或者分光光度计法都很难检测到。提取的质粒DNA如用于下列实验，通常建议使用量为：
用作PCR 模板：1-5 μl质粒DNA。
转化大肠杆菌：5-10 μl 质粒DNA。
● 所有离心步骤均为使用常规台式离心机室温下进行离心，速度为12,000 rpm（约13,400×g）。
● 溶液Eluent（10 mM Tris-HCl, pH 8.5）中不含EDTA，其收集的DNA片段可直接用于各种酶促反应等，不会影响后续试验。
● 为了保证回收效率，请不要使用未调整pH值的超纯水洗脱目的片段。
操作步骤--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
1 取酵母细胞液1-5 ml（细胞数最多不超过5×107）。12,000 rpm离心1min，尽量去除上清。
2 向菌体中加入300 μl溶壁酶反应缓冲液和50 U溶壁酶，涡旋振荡直至菌体完全悬浮。在摇床上220 r/min，30℃处理1 小时。
● 根据酵母菌株和数量的不同，所用溶壁酶用量和孵育时间应该进行适当调整。
3 5,000 rpm离心10min，去上清，收集沉淀。
4 加入250 µl溶液YⅠ/RNase A混合液，涡旋剧烈振荡直至菌体完全悬浮。室温静置1-2min。
● 初次使用本试剂盒时，请将RNase A全部加入到溶液YⅠ中，均匀混合后于 4℃保存。可保存6个月。
● 不要残留细小菌块。菌体悬浮充分与否将决定质粒DNA得率的高低。
● 室温静置1-2 min是为使溶液中的RNA被充分降解。
5 加入250 μl溶液YⅡ，轻柔地反复颠倒混匀5-6次。室温放置1-2 min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液。
● 若溶液YⅡ出现沉淀，请于37℃保温溶解。待恢复至室温后使用。沉淀的出现 不会影响质粒DNA的纯化结果。
● 不可剧烈混和，否则会使染色体DNA断裂。
● 此步骤不宜超过5 min。
6 加入350 μl溶液YⅢ，立即轻柔地反复颠倒混匀5-6次。此时会出现白色絮状沉淀。
7 12,000 rpm室温离心10 min，收集上清。
8 将上清置于DNA纯化柱中，静置1-2 min。
● 如果收集的上清液过多，超过DNA纯化柱容积（700 μl），可将上清分次加 入DNA纯化柱中。
9 12,000 rpm 离心1 min，弃滤液。
● 此时质粒DNA被吸附于DNA纯化柱的硅胶膜上。
10 加入500 μl 溶液PB，12,000 rpm 离心1 min，弃滤液。
● 此步骤的作用是将硅胶膜上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获得高质量质粒DNA。
11 加入500 μl溶液W，12,000 rpm 离心1 min，弃滤液。
● 溶液W初次使用前用无水乙醇按1: 1.5稀释，即含60%乙醇。
12 加入500 μl溶液W，12,000 rpm 离心1 min，弃滤液。
13 12,000 rpm离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体。
14 将DNA纯化柱置于新的离心管中。向纯化柱中央处，悬空滴加50-100 μl溶液Eluent，室温放置2 min。
15 12,000 rpm离心1 min， 管底即为高纯度质粒DNA。质粒DNA于-20℃保存。
● 溶液Eluent可用无菌双蒸水代替，但其pH需为8.0-8.5。溶液Eluent的加入体积视质粒拷贝数多少、用户对质粒浓度要求而定。
● 对溶液Eluent 65℃预热,会提高提取质粒的产量。
