果胶酶活性检测试剂盒说明书
微量法
注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
英文名称：Pectinase activity assay kit
关键词：果胶酶|果胶酶活性检测|果胶酶活性测定|果胶酶活性
货号：BC2635
规格：100T/48S
产品内容：
提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体 25mL×1 瓶，4℃保存。若溶液中有不溶解物质，可以 50℃水浴溶解。
试剂二：液体 20mL×1 瓶，4℃避光保存。
标准品：粉剂×1 支，10mg 半乳糖醛酸。临用前加入 0.943mL 蒸馏水，配成 50µmol/mL 的标准液
产品说明：
果胶酶（pectinase）是分解果胶的酶类，包括原果胶酶，果胶酯酶，多聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶四大类，广泛存在于高等植物果实和微生物中，是水果加工中最重要的酶。
果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸，半乳糖醛酸与 DNS 试剂反应生成在 540nm 有特征吸收峰的棕红色物质，测定 540nm 处吸光值变化可计算得果胶酶活性。
试验中所需的仪器和试剂：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、微量玻璃比色皿/96 孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、粗酶液提取：
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入
1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后 10000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
菌类：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加
入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 10000g，
4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
液体：直接检测。
二、测定步骤：
1、分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 540nm，蒸馏水调零。
2、将 50µmol/mL 标准液用蒸馏水稀释为 10、8、6、4、2、1µmol/mL 的标准溶液备用。
3、取 40µL 样本沸水浴 10min 备用。
4、操作表：(在 1.5mL 离心管中)
对照管测定管标准管空白管
试剂一（µL） 200 200 200 200
50℃水浴温育 5min
标准溶液（µL）- - 40 -
样本（µL） - 40 - -
蒸馏水（µL） - - - 40
煮沸样本（µL） 40 - - -
混匀，50℃水浴反应 30min，马上沸水浴 5min，冷却后 8000g，常温离心 10min，取上清。
上清液（µL） 150 150 150 150
试剂二（µL） 150 150 150 150
沸水浴 5min，冰浴冷却终止反应，吸取 200µL 于微量玻璃比色皿或 96 孔板中测定 540nm 处吸光值 A，计算△A=A 测定管-A 对照管，△A 标准=A 标准管-A 空白管。每个测定管需设一个对照管。
三、果胶酶活性计算
1、 标准曲线的绘制：
以各个标准溶液的浓度为 x 轴，其对应的△A 标准为 y 轴，绘制标准曲线，得到标准方程 y=kx+b，将△A 带入方程得到 x（µmol/mL）
2、 果胶酶活性的计算：
（1）按蛋白浓度计算
酶活定义：在 50℃，pH3.5 条件下，每毫克蛋白每小时分解果胶产生 1µmol 半乳糖醛酸为 1 个酶活力单位。
果胶酶活性（U/mg prot）=x×V 提取÷（V 提取×Cpr）÷T= 2x÷Cpr。
（2）按样本质量计算
酶活定义：在 50℃，pH3.5 条件下，每克样品每小时分解果胶产生 1µmol 半乳糖醛酸为 1 个酶活力单位。
果胶酶活（U/g 鲜重）= x×V 提取÷W÷T=2x÷W。
（3）按照细胞数量计算
酶活定义：在 50℃，pH3.5 条件下，每 104 个细胞每小时分解果胶产生 1µmol 半乳糖醛酸为 1个酶活力单位。
果胶酶活（U/104cell）= x×V 提取÷T÷细胞数量（万个）=2x÷细胞数量（万个）。
（4）按液体体积计算
酶活定义：在 50℃，pH3.5 条件下，每 mL 样本每小时分解果胶产生 1µmol 半乳糖醛酸为 1 个酶活力单位。
果胶酶活（U/mL）= x×V 样÷V 样÷T= 2x。
V 提取：提取液体积，1mL；
V 样：加入的样品体积，0.04mL；
Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；
W：样本质量，g；
T：反应时间：0.5h。
注意事项：
1、 A 大于 1.5 时，建议将样品稀释后再进行测定。
2、 植物果实组织建议将样本稀释 10 倍或 20 倍后再测定。
相关文献：
《Transcription factor VmSeb1 is required for the growth, development, and virulence in Valsa mali》 作者:Yuxing Wu,Liangsheng Xu,Zhiyuan Yin,Hao Feng,Lili Huang 期刊:Microbial Pathogenesis 影响因子:2.332 PMID:29959044
《Two members of the velvet family, VmVeA and VmVelB, affect conidiation, virulence and pectinase expression in Valsa mali》 作者:Yuxing Wu , Liangsheng Xu , Zhiyuan Yin , Qingqing Dai , Xiaoning Gao, Hao Feng , Ralf T. Voegele , Lili Huang 期刊:Molecular Plant Pathology 影响因子:4.379 PMID:29127722
