\n 细胞名称:细胞名称:HepG2-RHBV人肝癌细胞株HepG2-RHBV人肝癌细胞株
细胞英文(简称）:细胞英文(简称）:HepG2-RHBV
细胞来源: \xa0\xa0ATCC \xa0DSMZ \xa0\xa0JCM \xa0\xa0ECACC细胞来源: \xa0\xa0ATCC \xa0DSMZ \xa0\xa0JCM \xa0\xa0ECACC
代次:P3代次:P3
规格:T25规格:T25
细胞数:1x10^细胞数:1x10^⁶6\xa0cells\xa0cells
组织来源:组织来源:肝
细胞形态:细胞形态:贴壁贴壁
细胞活力:95％（Viability by Trypan Blue Exclusion）细胞活力:95％（Viability by Trypan Blue Exclusion）
细胞检测:细胞不含有:HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌细胞检测:细胞不含有:HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌
培养条件:培养条件:RPMI-1640 +10% FBS；37℃，5% CO2RPMI-1640 +10% FBS；37℃，5% CO2
传代方法建议:1:2-1:3 两天换液一次传代方法建议:1:2-1:3 两天换液一次
冻存条件:冻存条件:完全培养基50%+40%FBS+10%DMSO完全培养基50%+40%FBS+10%DMSO
传代细胞培养操作步骤传代细胞培养操作步骤
1、 \xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa037度水浴加热所有试剂。1、 \xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa037度水浴加热所有试剂。
2、 \xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa0吸取培养培养皿内旧培养液，放置一个干净离心管内。（为稍后终止消化作准备。）2、 \xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa0吸取培养培养皿内旧培养液，放置一个干净离心管内。（为稍后终止消化作准备。）
3、 \xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa0用PBS清洗培养皿，弃去。3、 \xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa0用PBS清洗培养皿，弃去。
4、 \xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa0向瓶内加入消化液（胰蛋白酶液）。以能覆盖培养瓶底为宜。（一般一个大皿1ml）4、 \xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa0向瓶内加入消化液（胰蛋白酶液）。以能覆盖培养瓶底为宜。（一般一个大皿1ml）
5、 \xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa02-5分钟后，轻轻震荡培养皿。使5、 \xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa02-5分钟后，轻轻震荡培养皿。使HepG2-RHBV人肝癌细胞株HepG2-RHBV人肝癌细胞株从瓶壁脱离形成细胞悬液。显微镜下观察若细胞由贴壁变为悬浮就加入血清（即原培养液）终止消化。从瓶壁脱离形成细胞悬液。显微镜下观察若细胞由贴壁变为悬浮就加入血清（即原培养液）终止消化。
6、 \xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa0收集细胞悬液，880转/分、5分钟离心，弃去上清液。6、 \xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa0收集细胞悬液，880转/分、5分钟离心，弃去上清液。
7、 \xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa0加培养液至1ml，混匀后取10ul计数细胞。7、 \xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa0加培养液至1ml，混匀后取10ul计数细胞。
8、 \xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa0根据实验要求取适量细胞留种或接种于新的培养皿或96孔板、24孔板中，再加入相应体积的培养液。（90mm大皿是9ml，中皿好像是4mm，6孔板和小皿是2ml，96孔板是100ul）。8、 \xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa0根据实验要求取适量细胞留种或接种于新的培养皿或96孔板、24孔板中，再加入相应体积的培养液。（90mm大皿是9ml，中皿好像是4mm，6孔板和小皿是2ml，96孔板是100ul）。
9、 \xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa0接种好的培养皿顺时针和逆时针各转三圈，使细胞排列均匀。9、 \xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa0接种好的培养皿顺时针和逆时针各转三圈，使细胞排列均匀。
10、 \xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa0放入暖箱中继续培养。10、 \xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa0\xa0放入暖箱中继续培养。
细胞计数步骤：细胞计数步骤：
1、将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上.1、将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上.
2、将细胞悬液吸出少许，用台盼兰溶液对被稀释后滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。(台盼兰用于标记死亡细胞。)2、将细胞悬液吸出少许，用台盼兰溶液对被稀释后滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。(台盼兰用于标记死亡细胞。)
3、镜下观察，计算计数板八大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：3、镜下观察，计算计数板八大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：
细胞数/ml＝8大格细胞总数/ 8×2×10000细胞数/ml＝8大格细胞总数/ 8×2×10000
细胞冻存与复苏：细胞冻存与复苏：
HepG2-RHBV人肝癌细胞株HepG2-RHBV人肝癌细胞株冻存和复苏的原则：慢冻快融冻存和复苏的原则：慢冻快融
当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。
如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶很大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶很大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。
\u3000\u30001．冻存细胞1．冻存细胞
（1）选对数增生期细胞，在冻存前1d换液。（1）选对数增生期细胞，在冻存前1d换液。
（2）按常规方法把培养细胞制备成悬液，计数，使细胞密度达5×106／m1左右密度，离心，去上清。（2）按常规方法把培养细胞制备成悬液，计数，使细胞密度达5×106／m1左右密度，离心，去上清。
（3）加入配制好的冻存液（培养液6.8ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml，5.6%NaHCO3 0.1ml），按与去上清相同的量一滴一滴加入离心管中,然后用吸管轻轻吹打令细胞成再悬液。冻存细胞时培养液中加入保护剂10％二甲基亚砜(DMSO) 或甘油，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤（3）加入配制好的冻存液（培养液6.8ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml，5.6%NaHCO3 0.1ml），按与去上清相同的量一滴一滴加入离心管中,然后用吸管轻轻吹打令细胞成再悬液。冻存细胞时培养液中加入保护剂10％二甲基亚砜(DMSO) 或甘油，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤
（4）分装于无菌冻存管中，每管加1.5m1悬液。（4）分装于无菌冻存管中，每管加1.5m1悬液。
（5）旋好冻存管并仔细检查，一定要盖紧，作好标记。（5）旋好冻存管并仔细检查，一定要盖紧，作好标记。
（6）冻存：在特殊的仪器或简易的液氮容器中，按-1℃／min的速度,在30～40 min时间内,下降到液氮表面，再停30 min后，直接投入液氮中。要适当掌握下降冷冻速度，过快能影响细胞内水分透出，太慢则促进冰晶形成。（6）冻存：在特殊的仪器或简易的液氮容器中，按-1℃／min的速度,在30～40 min时间内,下降到液氮表面，再停30 min后，直接投入液氮中。要适当掌握下降冷冻速度，过快能影响细胞内水分透出，太慢则促进冰晶形成。
标准程序：标准程序：
当温度在-25℃以上时， 1～2℃/min当温度在-25℃以上时， 1～2℃/min
当温度达-25℃以下时， 5～10℃/min当温度达-25℃以下时， 5～10℃/min
当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中
简易程序：简易程序：
将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2℃的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2℃的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。
\u3000\u3000操作时应戴防护眼镜和手套，以免液氮冻伤。\u3000\u3000操作时应戴防护眼镜和手套，以免液氮冻伤。
2. 复苏细胞2. 复苏细胞
（1）从罐中取出冻存管。（1）从罐中取出冻存管。
（2）迅速放入37℃水浴，不时摇动，使其急速融化，30～60s内完成。（2）迅速放入37℃水浴，不时摇动，使其急速融化，30～60s内完成。
（3）冻存管用70％酒精擦拭消毒后,打开盖子,用吸管将细胞悬液注入离心管中,再滴加10 m1培养液。（3）冻存管用70％酒精擦拭消毒后,打开盖子,用吸管将细胞悬液注入离心管中,再滴加10 m1培养液。
（4）（4）HepG2-RHBV人肝癌细胞株HepG2-RHBV人肝癌细胞株低速离心(880r／min) 5 min，去上清后再用培养液洗一次。低速离心(880r／min) 5 min，去上清后再用培养液洗一次。
（5）用培养液适当稀释后，装入培养瓶37℃培养，次日更换一次培养液后，继续培养。以后仍按常规进行培养。（5）用培养液适当稀释后，装入培养瓶37℃培养，次日更换一次培养液后，继续培养。以后仍按常规进行培养。
\u3000\u3000冻存细胞数量要充分，密度应达到107／m1，在融后稀释20倍后，仍能保持5×105／m1数量。\u3000\u3000冻存细胞数量要充分，密度应达到107／m1，在融后稀释20倍后，仍能保持5×105／m1数量。

\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t

90031402	FEA4 + PFSC/C1	91061232	WM-115	94101901	BW1J	6061905	HRA-16	85042502	MRC-5 SV1 TG2
90031403	Clone 81	91061233	WM 266-4	94101904	FGC4	6092001	H103	85050301	H9
90031532	BUD-8	91061307	AKR-2B	94101905	H5	6092003	H314	85050302	CHO
90031901	MSV.B	91062702	RAW 264.7	94101906	C2	6092005	H376	85051003	U266B1
90031902	MSVIF-TK+	91070510	MS	94101907	C2-Rev 7	6092006	H400	85051004	INT 407(HeLa derivative)
90032006	HCT-8	91072201	HT29	94101908	HF1	94072247	LC-2/ad	85051005	CHO-K1

\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t\t90031402\t\t\tFEA4 + PFSC/C1\t\t\t91061232\t\t\tWM-115\t\t\t94101901\t\t\tBW1J\t\t\t6061905\t\t\tHRA-16\t\t\t85042502\t\t\tMRC-5 SV1 TG2\t\t\t\t\t\t\t90031403\t\t\tClone 81\t\t\t91061233\t\t\tWM 266-4\t\t\t94101904\t\t\tFGC4\t\t\t6092001\t\t\tH103\t\t\t85050301\t\t\tH9\t\t\t\t\t\t\t90031532\t\t\tBUD-8\t\t\t91061307\t\t\tAKR-2B\t\t\t94101905\t\t\tH5\t\t\t6092003\t\t\tH314\t\t\t85050302\t\t\tCHO\t\t\t\t\t\t\t90031901\t\t\tMSV.B\t\t\t91062702\t\t\tRAW 264.7\t\t\t94101906\t\t\tC2\t\t\t6092005\t\t\tH376\t\t\t85051003\t\t\tU266B1\t\t\t\t\t\t\t90031902\t\t\tMSVIF-TK+\t\t\t91070510\t\t\tMS\t\t\t94101907\t\t\tC2-Rev 7\t\t\t6092006\t\t\tH400\t\t\t85051004\t\t\tINT 407(HeLa derivative)\t\t\t\t\t\t\t90032006\t\t\tHCT-8\t\t\t91072201\t\t\tHT29\t\t\t94101908\t\t\tHF1\t\t\t94072247\t\t\tLC-2/ad\t\t\t85051005\t\t\tCHO-K1\t\t\t\t\t\t\t\t90031402\t\t\tFEA4 + PFSC/C1\t\t\t91061232\t\t\tWM-115\t\t\t94101901\t\t\tBW1J\t\t\t6061905\t\t\tHRA-16\t\t\t85042502\t\t\tMRC-5 SV1 TG2\t\t\t\t\t9003140290031402\t\t\tFEA4 + PFSC/C1FEA4 + PFSC/C1\t\t\t9106123291061232\t\t\tWM-115WM-115\t\t\t9410190194101901\t\t\tBW1JBW1J\t\t\t60619056061905\t\t\tHRA-16HRA-16\t\t\t8504250285042502\t\t\tMRC-5 SV1 TG2MRC-5 SV1 TG2\t\t\t\t\t\t\t90031403\t\t\tClone 81\t\t\t91061233\t\t\tWM 266-4\t\t\t94101904\t\t\tFGC4\t\t\t6092001\t\t\tH103\t\t\t85050301\t\t\tH9\t\t\t\t\t9003140390031403\t\t\tClone 81Clone 81\t\t\t9106123391061233\t\t\tWM 266-4WM 266-4\t\t\t9410190494101904\t\t\tFGC4FGC4\t\t\t60920016092001\t\t\tH103H103\t\t\t8505030185050301\t\t\tH9H9\t\t\t\t\t\t\t90031532\t\t\tBUD-8\t\t\t91061307\t\t\tAKR-2B\t\t\t94101905\t\t\tH5\t\t\t6092003\t\t\tH314\t\t\t85050302\t\t\tCHO\t\t\t\t\t9003153290031532\t\t\tBUD-8BUD-8\t\t\t9106130791061307\t\t\tAKR-2BAKR-2B\t\t\t9410190594101905\t\t\tH5H5\t\t\t60920036092003\t\t\tH314H314\t\t\t8505030285050302\t\t\tCHOCHO\t\t\t\t\t\t\t90031901\t\t\tMSV.B\t\t\t91062702\t\t\tRAW 264.7\t\t\t94101906\t\t\tC2\t\t\t6092005\t\t\tH376\t\t\t85051003\t\t\tU266B1\t\t\t\t\t9003190190031901\t\t\tMSV.BMSV.B\t\t\t9106270291062702\t\t\tRAW 264.7RAW 264.7\t\t\t9410190694101906\t\t\tC2C2\t\t\t60920056092005\t\t\tH376H376\t\t\t8505100385051003\t\t\tU266B1U266B1\t\t\t\t\t\t\t90031902\t\t\tMSVIF-TK+\t\t\t91070510\t\t\tMS\t\t\t94101907\t\t\tC2-Rev 7\t\t\t6092006\t\t\tH400\t\t\t85051004\t\t\tINT 407(HeLa derivative)\t\t\t\t\t9003190290031902\t\t\tMSVIF-TK+MSVIF-TK+\t\t\t9107051091070510\t\t\tMSMS\t\t\t9410190794101907\t\t\tC2-Rev 7C2-Rev 7\t\t\t60920066092006\t\t\tH400H400\t\t\t8505100485051004\t\t\tINT 407(HeLa derivative)INT 407(HeLa derivative)\t\t\t\t\t\t\t90032006\t\t\tHCT-8\t\t\t91072201\t\t\tHT29\t\t\t94101908\t\t\tHF1\t\t\t94072247\t\t\tLC-2/ad\t\t\t85051005\t\t\tCHO-K1\t\t\t\t\t9003200690032006\t\t\tHCT-8HCT-8\t\t\t9107220191072201\t\t\tHT29HT29\t\t\t9410190894101908\t\t\tHF1HF1\t\t\t9407224794072247\t\t\tLC-2/adLC-2/ad\t\t\t8505100585051005\t\t\tCHO-K1CHO-K1