组织型纤维蛋白溶酶原激活剂（tissue type Plasminogen Activator；tPA或PLAT；EC3.4.21.68），属于丝氨酸蛋白酶，存在于内皮细胞（endothelial）中。其功能在于使纤维蛋白溶酶原（Plasminogen），即纤维蛋白溶酶（plasmin）的酶原形式（zymogen）转化为具有活性的纤维蛋白溶酶，水解可溶性纤维蛋白（fibrin），参与血管内血栓溶解通路，以及细胞迁移和组织重塑。在神经系统，组织型纤维蛋白溶酶原激活剂与突触可塑性（synaptic plasticity）、细胞凋亡等有关。活性过高，则导致纤溶亢进（hyperfibrinolysis），而出血过多，但在肿瘤转移中起到抑制作用；活性过低，则导致纤溶不足，而血栓形成，或神经退行性变化。一旦异常，将产生肺栓塞、心肌梗塞和中风。临床上用于治疗血栓性中风（embolic or thrombotic stroke）和心肌梗塞。同时高度表达的组织型纤维蛋白溶酶原激活剂时乳腺癌的预后良好的标记。人体血浆中含有纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂I（plasminogen activator inhibitor type 1；PAI-1）和C1抑制剂。基于人工合成的多肽化合物底物CH3SO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA（Methylsulfonyl-D-hexahydrotyrosine-glycyl-arginine-p-Nitroaniline；甲基磺酰-D-六氢酪氨酸甘氨酰精氨酰对硝基苯胺）受到组织型纤维蛋白溶酶原激活剂的水解，释放有色对硝基苯胺，在分光光度仪（405nm波长）下，测定吸光峰值的变化，来定量测定组织型纤维蛋白溶酶原激活剂的活性。其反应系统为：

产品内容

HEPENGBIO缓冲液（Reagent A）毫升

HEPENGBIO阴性液（Reagent B）毫升

HEPENGBIO底物液（Reagent C）微升

产品说明书 1份

保存方式

保存在-20℃冰箱里；HEPENGBIO底物液（Reagent C）避免光照和反复冻融；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品制备和储存的容器

微型台式离心机：用于样品操作

培养箱：用于反应物孵育

96孔板或100微升1厘米光径比色皿：用于样品比色测定的容器

酶标仪或分光光度仪：用于样品比色分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的HEPENGBIO底物液（Reagent C）置入冰槽里融化，避免光照。然后进行下列操作。

一、 样品制备

1． 准备好ACD抗凝管（注意：避免使用EDTA和肝素抗凝管）

2． 抽取1毫升血液，置于抗凝管里

3． 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）

4． 小心移取上层黄色液体到新的1.5毫升离心管――此为血浆成分（注意：避免触碰白色液体层）

5． （选择步骤）移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用HEPENGBIOBradford蛋白质浓度定量试剂盒－HEPENGBIO30030.1）

6． 即刻置于冰槽里备用或放进－70℃冰箱里保存

二、 测定准备

1． 准备好上述制备的待测样品

2． 设定好分光光度仪或酶标仪（温度为37℃）：波长405nm，并置零

3． HEPENGBIO缓冲液（Reagent A）室温下均衡温度

三、 活性测定

1． 在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品

2． 分别移取xx微升HEPENGBIO缓冲液（Reagent A）到相应孔里

3． 分别加入xx微升HEPENGBIO阴性液（Reagent B）或上述制备的待测样品（50微克蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）

4． 分别加入xx微升HEPENGBIO底物液（Reagent C）

5． 轻轻摇动96孔板（注意：避免气泡）

6． 在37℃温度下孵育60分钟（注意：可见反应孔里呈现肉眼可见的黄色）

7． 即刻放进酶标仪检测或转移到100微升比色皿，在分光光度仪里检测

8． 活性计算：

（1） 酶标仪检测

（2） 比色皿检测

注意事项

1． 本产品为21次操作，包括背景对照

2． 操作时，须戴手套

3． 系统操作过程中，背景测定只需1次

4． 样品须澄清，且避免反复冻融

5． 测定值由低到高变化；测定可持续60分钟

6． 比色测定后，比色皿须清洗彻底

7． 样本测定60分钟读数高于0分钟读数表明具有酶活性

8． 建议待测样本蛋白浓度为50微克/5微升；如果样本酶活性过低，则可以延长反应孵育时间；其次增加样本量（本公司提供 HEPENGBIO Bradford蛋白质浓度定量试剂盒

9． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

10． 组织型纤维蛋白溶酶原激活剂单位活性定义为：在37℃，pH 8.4条件下，每分钟内能够切离1微摩尔多肽化合物底物CH3SO2-D-HHT-Gly-Arg-pNA所需的酶量作为一个活性单位

11． 本公司提供系列细胞蛋白酶学检测试剂产品