HEPENGBIO动物肿瘤组织细胞分离培养试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

HEPENGBIO动物肿瘤组织细胞分离培养试剂是一种旨在从动物活体肿瘤组织中分离出活力保证、高度纯化的原代肿瘤细胞的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。适合于各种动物（小鼠、大鼠、人等）肿瘤组织（乳腺、肝、脑、皮肤等）细胞的制备。其制备产量高，活力保证，纯度可达90％。可以被用于肿瘤细胞的发生、发展和转移机制、肿瘤细胞生物学和分子生物学，以及免疫治疗学等的研究。产品即到即用，严格无菌、性能稳定，分离产量和纯度俱佳。

技术背景

肿瘤细胞转化是经过一系列遗传和表观遗传的异常改变而产生的一组细胞群，其独立于正常细胞限制的外在和内在信号而不断繁殖。肿瘤细胞的分离和特征分析在于理解肿瘤细胞的发生和转移机制，以及生物标记的发现。 

产品内容

HEPENGBIO清理液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO酶解液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO中和液（Reagent C） 毫升
HEPENGBIO溶血液（Reagent D） 毫升
产品说明书 1份

保存方式

保存HEPENGBIO酶解液（Reagent B）和HEPENGBIO中和液（Reagent C）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；有效保证6月

用户自备

肿瘤细胞培养液：用于纯化的肿瘤细胞的后续培养
2升三角烧瓶：用于盛放麻醉动物的容器
乙醚：用于麻醉动物
手术器械：用于解剖动物
恒温水浴摇床：用于孵育反应
15毫升锥形离心管：用于细胞制备的容器
50毫升锥形离心管：用于细胞制备的容器
10毫升移液管：用于破碎组织
40微米无菌尼龙网：用于分离细胞
25cm2细胞培养瓶或35mm细胞培养皿或6孔细胞培养板：用于原代细胞培养的容器
4℃台式离心机：用于沉淀细胞
光学显微镜：用于观察细胞形态

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置于冰槽里冻融，同时将用户自备的肿瘤细胞培养液置于37℃恒温水槽预热。然后进行下列操作。

1．准备1个2升三角烧瓶
2．放入300至500克左右的大鼠 
3．注入2毫升乙醚，盖上 
4．观察大鼠，直至其四肢瘫软、背部肌肉松驰
5．取出大鼠，局部消毒
6．手术取出肿瘤组织（注意：尽量去除附着在肿瘤组织上的正常组织）
7．放进50毫升锥形离心管（注意：新鲜肿瘤组织在1小时内进行后续操作）
8．加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）清洗一次
9．即刻用刀片轻柔切碎组织（1至2毫米大小）
10．放进15毫升锥形离心管
11．加入xx毫升HEPENGBIO酶解液（Reagent B）
12．放进37℃恒温摇床孵育4小时
13．使用10毫升移液管快速抽吸5次（注意：避免气泡）
14．室温下静置5分钟
15．加入xx毫升HEPENGBIO中和液（Reagent C），混匀
16．小心移取上清液（不含组织颗粒）或使用40微米无菌尼龙网过滤到新的15毫升锥形离心管
17．放进台式离心机离心5分钟，速度为300g
18．小心抽去上清液
19．加入xx毫升HEPENGBIO中和液（Reagent C）
20．混匀细胞颗粒群
21．放进台式离心机离心5分钟，速度为300g
22．小心抽去上清液
23．（选择步骤）加入xx毫升HEPENGBIO溶血液（Reagent D），混匀细胞颗粒群
24．（选择步骤）室温下孵育3分钟
25．（选择步骤）放进台式离心机离心5分钟，速度为300g
26．（选择步骤）小心抽去上清液
27．加入xx毫升HEPENGBIO清理液（Reagent A）
28．混匀细胞颗粒群
29．放进台式离心机离心5分钟，速度为300g
30．小心抽去上清液
31．重复实验步骤27至30一次
32．加入5毫升37℃预热的用户自备的肿瘤细胞培养液，混匀细胞颗粒群
33．转移到25cm2细胞培养瓶或35mm细胞培养皿或6孔细胞培养板的1孔
34．放进37℃二氧化碳细胞培养箱孵育24至48小时或直至细胞贴壁
35．更换一半培养液（注意：如果6小时已经贴壁，就可以更换一半培养液）
36．以后，每间隔5天更换一半培养液一次，直至细胞生长铺满培养瓶或培养皿平面（注意：避免培养液颜色呈现黄色）
37．光学显微镜观察

注意事项

1．本产品为10次操作
2．本产品可用于分离各种肿瘤细胞，例如前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺肿瘤、肠癌等 
3．所有操作均须在无菌状态下进行
4．本产品获得的细胞存活率可达70至95%不等
5．分离的肿瘤细胞活力检测建议使用HEPENGBIO细胞活力台盼蓝染色试剂盒－HEPENGBIO10009
6．进一步单一肿瘤细胞的克隆分离可以使用抗体或磁珠方法
7．用户根据不同肿瘤细胞种类，使用相应的肿瘤细胞专性培养基
8．本公司提供系列细胞培养产品

质量标准

1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定分离的细胞维持正常活性
3．本产品经鉴定分离的细胞纯度达90％