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CRISPR-Cas9基因敲除
CRISPR-Cas9基因敲除CRISPR-Cas9基因敲除一、原理及应用介绍
一、原理及应用介绍一、原理及应用介绍\xa0 \xa0 \xa0CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9）系统是目前被广泛运用的基因编辑系统，其原理是由CRISPR转录产生的sgRNA(small guide RNA)识别并结合目标基因的靶向序列，引导Cas9对结合位点进行剪切，产生DNA双链断裂（double-strand break，DSB），机体自身通过非同源末端重组（non-homologous end joining，NHEJ）的方式修复DSB，参与修复的蛋白经常会在DNA末端插入或删除几个碱基，修复后的基因由于产生突变而导致功能丧失，从而实现机体内的基因敲除（Gene Knockout）。
\xa0 \xa0 \xa0CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9）CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9）系统是目前被广泛运用的基因编辑系统，其原理是由CRISPR转录产生的sgRNA(small guide RNA)识别并结合目标基因的靶向序列，引导Cas9对结合位点进行剪切，产生DNA双链断裂（double-strand break，DSB），机体自身通过非同源末端重组（non-homologous end joining，NHEJ）的方式修复DSB，参与修复的蛋白经常会在DNA末端插入或删除几个碱基，修复后的基因由于产生突变而导致功能丧失，从而实现机体内的基因敲除（Gene Knockout）。
图1.CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑（Wiles MV,et al.Mamm Genome,2015）
图1.CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑（Wiles MV,et al.Mamm Genome,2015）\xa0
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图2.非同源重组修复DSB（Wiles MV,et al.Mamm Genome,2015）
图2.非同源重组修复DSB（Wiles MV,et al.Mamm Genome,2015）\xa0
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\xa0应用实例
应用实例应用实例1.利用CRISPR/Cas9去除HBV感染（Zhen S, et al.Gene Ther.2015）
1.利用CRISPR/Cas9去除HBV感染（Zhen S, et al.Gene Ther.2015）1.利用CRISPR/Cas9去除HBV感染（Zhen S, et al.Gene Ther.2015）
图3.靶向HBV基因组不同位置的gRNA
图3.靶向HBV基因组不同位置的gRNA\xa0
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图4.靶向S基因的gRNA-S1和靶向X基因的gRNA-X3介导Cas9对HBV基因组的编辑产生突变，被T7E1错配酶识别
图4.靶向S基因的gRNA-S1和靶向X基因的gRNA-X3介导Cas9对HBV基因组的编辑产生突变，被T7E1错配酶识别\xa0
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图5.Cas9和gRNA-(S1+X)共转至HBV转基因小鼠模型，能持续抑制血清中乙肝标志性抗原（HBsAg）的含量
图5.Cas9和gRNA-(S1+X)共转至HBV转基因小鼠模型，能持续抑制血清中乙肝标志性抗原（HBsAg）的含量\xa0
\xa02.利用CRISPR/Cas9进行基因治疗（Maeder ML, et al.Nat Med.2019）
2.利用CRISPR/Cas9进行基因治疗（Maeder ML, et al.Nat Med.2019）2.利用CRISPR/Cas9进行基因治疗（Maeder ML, et al.Nat Med.2019）\xa0 \xa0 \xa0莱伯氏先天性黑曚10型是一种单基因遗传病，是由于CEP290基因第26号和第27号外显子之间的突变造成mRNA错误剪接从而导致蛋白质缺失引起的，基因治疗公司Editas利用AAV载体表达SaCas9和靶向突变位点两端的gRNA，在体对CEP290基因进行编辑，删除突变的内含子序列或造成该区域翻转从而破坏错误的剪接位点，帮助形成正确的mRNA。
\xa0 \xa0 \xa0莱伯氏先天性黑曚10型是一种单基因遗传病，是由于CEP290基因第26号和第27号外显子之间的突变造成mRNA错误剪接从而导致蛋白质缺失引起的，基因治疗公司Editas利用AAV载体表达SaCas9和靶向突变位点两端的gRNA，在体对CEP290基因进行编辑，删除突变的内含子序列或造成该区域翻转从而破坏错误的剪接位点，帮助形成正确的mRNA。
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\xa03.利用CRISPR/Cas9技术构建肿瘤模型（Maresch R, et al.Nat Commun.2016）
3.利用CRISPR/Cas9技术构建肿瘤模型（Maresch R, et al.Nat Commun.2016）3.利用CRISPR/Cas9技术构建肿瘤模型（Maresch R, et al.Nat Commun.2016）\xa0 \xa0 \xa0超过90%的人胰腺癌有KRAS突变，利用Ptf1a-Cre在胰腺特异诱导KRAS G12D突变基因表达,能诱导小鼠产生胰腺癌，但所需时间长达数月甚至一年以上。利用CRISPR-Cas9基因编辑在上述小鼠模型体内同时突变15个与胰腺导管腺癌（PDAC)相关的基因，可快速诱导PDAC产生，诱导成瘤中位时间为10周左右，到第24周，约54%的基因编辑小鼠能产生肿瘤。
\xa0 \xa0 \xa0超过90%的人胰腺癌有KRAS突变，利用Ptf1a-Cre在胰腺特异诱导KRAS G12D突变基因表达,能诱导小鼠产生胰腺癌，但所需时间长达数月甚至一年以上。利用CRISPR-Cas9基因编辑在上述小鼠模型体内同时突变15个与胰腺导管腺癌（PDAC)相关的基因，可快速诱导PDAC产生，诱导成瘤中位时间为10周左右，到第24周，约54%的基因编辑小鼠能产生肿瘤。\xa0
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\xa0二、我司提供病毒载体及细胞系构建服务
二、我司提供病毒载体及细胞系构建服务二、我司提供病毒载体及细胞系构建服务服务内容
服务内容服务内容1、sgRNA的设计；
1、sgRNA的设计；2、细胞内sgRNA剪切活性筛选；
2、细胞内sgRNA剪切活性筛选；3、敲除载体的构建；
3、敲除载体的构建；4、依据所要编辑的细胞选择Cas9和sgRNA不同导入方式：
4、依据所要编辑的细胞选择Cas9和sgRNA不同导入方式：\xa0 \xa0 \xa0a、脂质体易转染细胞：使用质粒系统（Cas9和sgRNA）；
\xa0 \xa0 \xa0b、脂质体难转染细胞：使用质粒系统电转化、慢病毒或腺相关病毒感染（Cas9和sgRNA）；
5、筛选基因敲除单克隆细胞系。
5、筛选基因敲除单克隆细胞系。\xa0
\xa0服务流程
服务流程服务流程
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\xa0需客户提供
需客户提供需客户提供1、目的基因序列（ID）以及物种来源；
2、需介导基因敲除的细胞（可选）；
3、病毒类型选择以及要求；
4、血清型选择。
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\xa0表1.服务信息及最终交付内容、产品
表1.服务信息及最终交付内容、产品
