产品信息产品信息
产品名称：大鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化试剂盒
货号：CHEM-200015
批号：见包装
试剂清单：

序号	名称	数量	货号
A	大鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化基础培养基	2	CHEM-200015-A
B	双抗	2	CHEM-200015-B
C	抗坏血酸	2	CHEM-200015-C
D	acetone酸钠	2	CHEM-200015-D
E	地塞米松	2	CHEM-200015-E
F	脯氨酸	2	CHEM-200015-F
G	ITS+Premix	2	CHEM-200015-G
H	TGF-β3	2	CHEM-200015-H
I	阿利新蓝染色液	1	CHEM-200015-I

序号名称数量货号A大鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化基础培养基2CHEM-200015-AB双抗2CHEM-200015-BC抗坏血酸2CHEM-200015-CDacetone酸钠2CHEM-200015-DE地塞米松2CHEM-200015-EF脯氨酸2CHEM-200015-FGITS+Premix2CHEM-200015-GHTGF-β32CHEM-200015-HI阿利新蓝染色液1CHEM-200015-I序号名称数量货号序号序号名称名称数量数量货号货号A大鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化基础培养基2CHEM-200015-AAAA大鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化基础培养基大鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化基础培养基大鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化基础培养基22CHEM-200015-ACHEM-200015-AB双抗2CHEM-200015-BBBB双抗双抗22CHEM-200015-BCHEM-200015-BC抗坏血酸2CHEM-200015-CCCC抗坏血酸抗坏血酸22CHEM-200015-CCHEM-200015-CDacetone酸钠2CHEM-200015-DDDDacetone酸钠acetone酸钠22CHEM-200015-DCHEM-200015-DE地塞米松2CHEM-200015-EEEE地塞米松地塞米松222CHEM-200015-ECHEM-200015-EF脯氨酸2CHEM-200015-FFFF脯氨酸脯氨酸22CHEM-200015-FCHEM-200015-FGITS+Premix2CHEM-200015-GGGGITS+PremixITS+Premix22CHEM-200015-GCHEM-200015-GHTGF-β32CHEM-200015-HHHHTGF-β3TGF-β322CHEM-200015-HCHEM-200015-HI阿利新蓝染色液1CHEM-200015-IIII阿利新蓝染色液阿利新蓝染色液11CHEM-200015-ICHEM-200015-I 存储与有效期：
A、E、J液于2-8 ℃避光保存，其余溶液于-20 ℃（或更低温度）避光保存。所有组分均需要避免反复冻融及复温，I液有效期为6个月，其他组分在所需要的温度下有效期为1年。预混液于2-8 ℃保存，有效期为1个月，完全培养基现配现用。
产品介绍产品介绍
大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSC）具有多向分化的潜能，体外在一定条件下可以诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞。2006年国际细胞治疗协会（ISCT）确定此三项检测指标是MSC鉴定的必检项目，目前以MSC为基础的研究报道均会对该三个指标进行鉴定。
为方便科研用户鉴定rBMSC的分化能力，麒盟干细胞研究中心精心优化rBMSC成软骨诱导分化试剂盒，其中包括成软骨诱导培养体系和鉴定所需要的染色液，让用户可以稳定有效地鉴定rBMSC的分化潜能。该试剂盒提供的实验方法为常规鉴定方法，用于鉴定rBMSC是否具有成骨分化能力。除此以外，试剂盒的诱导培养基还可用于诱导分化过程中的其他检测，如mRNA检测、lncRNA检测、microRNA检测、蛋白表达检测、免疫组化检测等。但若用于免疫荧光检测需注意自发荧光或固定方法问题。
本产品仅适用于科研。
操作方法操作方法
实验准备实验准备
² 试剂配制：
预混液预混液：室温融化B-G溶液各一支，将融化的溶液B-G加入A液中，晃动培养基使其充分混匀，配制成软骨分化培养基预混液。
注意：注意：注意：溶液溶解后旋涡混匀、溶液溶解后旋涡混匀、1000 g1000 g短时离心以使溶液集中于管底。将管内溶液加入短时离心以使溶液集中于管底。将管内溶液加入AA液后，吸取液后，吸取AA液洗涤溶液瓶两次，将洗涤液加入液洗涤溶液瓶两次，将洗涤液加入AA液中。所有液体混合成预混液必须充分混匀，液中。所有液体混合成预混液必须充分混匀，2-8 2-8 ℃℃保存。保存。
TGF-TGF-ββ33分装分装：室温溶解I液，根据每次换液需要的试剂量分装成小份，-20℃或更低温度保存。
诱导完全培养基诱导完全培养基：按照当次所需要的诱导液总量取相应的预混液与离心管中，加入相应量的TGF-β3，充分混匀制成诱导完全培养基，此液现配现用。1ml预混液需添加TGF-β3的量为10 μl。
注意：注意：注意：II液可以根据需要分装成不同小份，液可以根据需要分装成不同小份，-20-20℃或更低温度保存，每次使用时按照当次使用的量配制诱导完全培养基，完全培养基必须现配现用。整个过程需无菌操作，适当以℃或更低温度保存，每次使用时按照当次使用的量配制诱导完全培养基，完全培养基必须现配现用。整个过程需无菌操作，适当以75%75%酒精擦拭表面。酒精擦拭表面。
² 自备试剂：
l 消化液（0.25%Trypsin-0.04%EDTA）
l 磷酸盐缓冲液（DPBS）
l rBMSC完全培养基
l 4%中性固定溶液
注意：注意：注意：若若rBMSCrBMSC完全培养基不含血清，则需要准备胰酶抑制剂。完全培养基不含血清，则需要准备胰酶抑制剂。rBMSCrBMSC消化极易过度，建议稀释消化液一倍，且严格控制消化时间。消化极易过度，建议稀释消化液一倍，且严格控制消化时间。
操作步骤操作步骤
1. 准备所需诱导分化的rBMSC，当细胞融合达85%左右时，用消化液消化细胞，细胞沉淀用成软骨诱导预混液重悬。
2. 150g离心5min，沉淀以预混液重悬，细胞密度约1×10⁶6cells/ml，再次离心，弃上清。
3. 沉淀以成软骨诱导完全培养基重新悬浮，调整细胞密度为5×10⁵5cells/ml。
4. 分别取500μl细胞悬液接种于15ml离心管中，150g离心5min。
注意：注意：注意：成软骨诱导时每管细胞的总数在成软骨诱导时每管细胞的总数在55××10⁴10⁴4至至33××10⁵10⁵5之间，细胞数过少形成的软骨团块可能较小，细胞数过多则倾向于分开成块。正常情况下可形成之间，细胞数过少形成的软骨团块可能较小，细胞数过多则倾向于分开成块。正常情况下可形成1mm³1mm³3的团块。的团块。
5. 旋松离心管盖，将离心管轻轻置于37℃、5% CO₂2培养箱中静置培养。
注意：注意：注意：24 h24 h内避免摇动细胞沉淀，以确保形成个团块。离心管需使用聚丙烯材质无菌管。内避免摇动细胞沉淀，以确保形成个团块。离心管需使用聚丙烯材质无菌管。
6. 诱导培养24h后，轻轻拨动离心管底，使细胞沉淀团块悬浮，重新放回培养箱继续培养。
注意：注意：注意：细胞团块重新悬浮的时间因细胞而定，基本在细胞团块重新悬浮的时间因细胞而定，基本在24-48h24-48h之间，以细胞团周围有聚拢现象时为准。之间，以细胞团周围有聚拢现象时为准。
7. 每2天更换新鲜完全诱导培养基。换液时轻轻吸取旧培养基，每管加新鲜配制的成软骨分化完全培养基500μl。
注意：注意：注意：换液时动作轻柔，以免吸出软骨团块；诱导液必须经过复温，否则影响诱导效果。在诱导培养换液时动作轻柔，以免吸出软骨团块；诱导液必须经过复温，否则影响诱导效果。在诱导培养2-32-3周后会出现大量细胞外基质，富含软骨蛋白多糖和Ⅱ型胶原。周后会出现大量细胞外基质，富含软骨蛋白多糖和Ⅱ型胶原。
8. 诱导培养结束时，弃去培养上清，DPBS洗细胞两次，4%中性固定溶液2 ml/管室温固定细胞1小时。
注意：注意：注意：培养结束时或中途可以选择其他检测方法，如基因表达检测等，若采用自己拟定的检测方法则后续方案需要自己拟定。培养结束时或中途可以选择其他检测方法，如基因表达检测等，若采用自己拟定的检测方法则后续方案需要自己拟定。
9. 弃去固定液，DPBS洗2次，脱水、石蜡包埋后切片。
注意：注意：注意：脱水包埋可以用擦镜纸包裹后使用自动脱水机脱水、包埋，也可以在原离心管中逐级更换脱水、透蜡的液体，手工包埋。过程中一定注意团块不要丢失。脱水包埋可以用擦镜纸包裹后使用自动脱水机脱水、包埋，也可以在原离心管中逐级更换脱水、透蜡的液体，手工包埋。过程中一定注意团块不要丢失。
10. 阿利新蓝染色：将切片进行脱腊和复水，阿利新蓝染液染色30min，流水冲洗5min，脱水、透明、中性树胶封片，显微镜下观察、拍照。
注意：注意：注意：染色和制片过程中避免干片，干片后会导致组织形态发生变化，影响观察、拍照效果。根据需要可以选择苏木素复染。染色和制片过程中避免干片，干片后会导致组织形态发生变化，影响观察、拍照效果。根据需要可以选择苏木素复染。
11. 结果判定：结果判定：按照程序操作完毕，低倍镜下观察可见蓝色着色，该蓝色染色的为酸性粘多糖，说明实验所用的rBMSC具有成软骨能力。否则，所使用的rBMSC无成软骨能力。


结果展示结果展示

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