大鼠羊膜间质细胞/大鼠羊膜间质细胞/大鼠羊膜间质细胞大鼠羊膜间质细胞/大鼠羊膜间质细胞/大鼠羊膜间质细胞大鼠羊膜间质细胞/大鼠羊膜间质细胞/大鼠羊膜间质细胞大鼠羊膜间质细胞/大鼠羊膜间质细胞/大鼠羊膜间质细胞大鼠羊膜间质细胞大鼠羊膜间质细胞/大鼠羊膜间质细胞大鼠羊膜间质细胞//大鼠羊膜间质细胞大鼠羊膜间质细胞

实验目的和要求：
实验目的和要求：
实验目的和要求：
实验目的和要求：
实验目的和要求：
实验目的和要求：
掌握无菌操作技术。掌握无菌操作技术。掌握无菌操作技术。掌握无菌操作技术。掌握无菌操作技术。掌握无菌操作技术。
了解小鼠解剖操作技术。了解小鼠解剖操作技术。了解小鼠解剖操作技术。了解小鼠解剖操作技术。了解小鼠解剖操作技术。了解小鼠解剖操作技术。
了解原代细胞培养的一般方法与步骤了解原代细胞培养的一般方法与步骤了解原代细胞培养的一般方法与步骤了解原代细胞培养的一般方法与步骤了解原代了解原代 细胞培养细胞培养 的一般方法与步骤的一般方法与步骤
了解培养细胞的消化分散。了解培养细胞的消化分散。了解培养细胞的消化分散。了解培养细胞的消化分散。了解培养细胞的消化分散。了解培养细胞的消化分散。
了解细胞计数方法。了解细胞计数方法。了解细胞计数方法。了解细胞计数方法。了解细胞计数方法。了解细胞计数方法。
了解倒置显微镜的使用。了解倒置显微镜的使用。了解倒置显微镜的使用。了解倒置显微镜的使用。了解倒置显微镜的使用。了解倒置显微镜的使用。

实验原理：实验原理：实验原理：实验原理：实验原理实验原理 ：：

原代细胞培养原代细胞培养原代细胞培养原代细胞培养原代原代 细胞培养细胞培养
是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、以及细胞的衰老，死亡等生命现象。是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、以及细胞的衰老，死亡等生命现象。是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、以及细胞的衰老，死亡等生命现象。是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、以及细胞的衰老，死亡等生命现象。是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、以及细胞的衰老，死亡等生命现象。是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制、以及细胞的衰老，死亡等生命现象。

实验内容：实验内容：实验内容：实验内容：实验内容：实验内容：

动物的选择：动物的选择：动物的选择：动物的选择：动物的选择：动物的选择：
选择大约一半足孕时间的胚胎，10－13天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞，成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。选择大约一半足孕时间的胚胎，10－13天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞，成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。选择大约一半足孕时间的胚胎，10－13天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞，成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。选择大约一半足孕时间的胚胎，10－13天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞，成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。选择大约一半足孕时间的胚胎，选择大约一半足孕时间的胚胎，10－－1313天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞，成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。天龄胚胎含有最大数量的未分化的间质细胞，成纤维细胞可从这些细胞衍生获得。
每组小鼠胚胎1个每组小鼠胚胎1个每组小鼠胚胎1个每组小鼠胚胎1个每组小鼠胚胎每组小鼠胚胎1个个

实验材料：实验材料：实验材料：实验材料：实验材料：实验材料：
每组的超净台中有以下物品：每组的超净台中有以下物品：每组的超净台中有以下物品：每组的超净台中有以下物品：每组的超净台中有以下物品：每组的超净台中有以下物品：
1. 50ml 配制好的RPMI1640培养液1瓶；8ml小牛血清（FCS) 1瓶；100ml 0.25%胰蛋白酶 1瓶；PBS(-)1 瓶1. 50ml 配制好的RPMI1640培养液1瓶；8ml小牛血清（FCS) 1瓶；100ml 0.25%胰蛋白酶 1瓶；PBS(-)1 瓶1. 50ml 配制好的RPMI1640培养液1瓶；8ml小牛血清（FCS) 1瓶；100ml 0.25%胰蛋白酶 1瓶；PBS(-)1 瓶1. 50ml 配制好的RPMI1640培养液1瓶；8ml小牛血清（FCS) 1瓶；100ml 0.25%胰蛋白酶 1瓶；PBS(-)1 瓶1. 50ml 配制好的配制好的RPMI1640RPMI1640培养液培养液11瓶；瓶；8ml8ml小牛血清（小牛血清（FCS) 1FCS) 1瓶；瓶；100ml 0.25%100ml 0.25%胰蛋白酶 胰蛋白酶 11瓶；瓶；PBS(-)1 PBS(-)1 瓶瓶
2. 100ml灭菌烧杯2个；2. 100ml灭菌烧杯2个；2. 100ml灭菌烧杯2个；2. 100ml灭菌烧杯2个；2. 100ml灭菌烧杯灭菌烧杯22个；个；
3、50ml离心筒2个3、50ml离心筒2个3、50ml离心筒2个3、50ml离心筒2个3、、50ml50ml离心筒离心筒22个个
4、灭菌培养皿1个， 细胞培养 瓶1个4、灭菌培养皿1个， 细胞培养 瓶1个4、灭菌培养皿1个， 细胞培养 瓶1个4、灭菌培养皿1个， 细胞培养 瓶1个4、灭菌培养皿、灭菌培养皿11个， 细胞培养 瓶个， 细胞培养 瓶11个个
4、1ml ，200μl移液器各1支；枪头盒2个；无菌玻璃搅拌棒1个4、1ml ，200μl移液器各1支；枪头盒2个；无菌玻璃搅拌棒1个4、1ml ，200μl移液器各1支；枪头盒2个；无菌玻璃搅拌棒1个4、1ml ，200μl移液器各1支；枪头盒2个；无菌玻璃搅拌棒1个4、、1ml 1ml ，，200200μμll移液器各移液器各11支；枪头盒支；枪头盒22个；无菌玻璃搅拌棒个；无菌玻璃搅拌棒11个个
5、细胞计数板1块；5、细胞计数板1块；5、细胞计数板1块；5、细胞计数板1块；5、细胞计数板、细胞计数板11块；块；
6、灭好菌的镊子1把，剪刀1把；6、灭好菌的镊子1把，剪刀1把；6、灭好菌的镊子1把，剪刀1把；6、灭好菌的镊子1把，剪刀1把；6、灭好菌的镊子、灭好菌的镊子11把，剪刀把，剪刀11把；把；
7、酒精灯1台；7、酒精灯1台；7、酒精灯1台；7、酒精灯1台；7、酒精灯、酒精灯11台；台；

试验操作步骤：试验操作步骤：试验操作步骤：试验操作步骤：试验操作步骤：试验操作步骤：
1)胚胎的分离。适用哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠)1)胚胎的分离。适用哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠)1)胚胎的分离。适用哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠)1)胚胎的分离。适用哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠)1)胚胎的分离。适用哺乳动物胚胎的分离。适用哺乳动物((仓鼠、小鼠和大鼠仓鼠、小鼠和大鼠))
a．采用认可的方案处死啮齿动物。a．采用认可的方案处死啮齿动物。a．采用认可的方案处死啮齿动物。a．采用认可的方案处死啮齿动物。a．采用认可的方案处死啮齿动物。．采用认可的方案处死啮齿动物。
b．立即在无菌超净台内用70％乙醇擦洗整个动物。b．立即在无菌超净台内用70％乙醇擦洗整个动物。b．立即在无菌超净台内用70％乙醇擦洗整个动物。b．立即在无菌超净台内用70％乙醇擦洗整个动物。b．立即在无菌超净台内用．立即在无菌超净台内用7070％乙醇擦洗整个动物。％乙醇擦洗整个动物。
c．用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。c．用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。c．用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。c．用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。c．用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。．用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。
d．用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。d．用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。d．用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。d．用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。d．用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。．用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。
e．剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌PBS的100ml烧杯中。e．剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌PBS的100ml烧杯中。e．剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌PBS的100ml烧杯中。e．剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌PBS的100ml烧杯中。e．剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌．剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌PBSPBS的的100ml100ml烧杯中。烧杯中。
f．漂洗胚胎，去掉PBS。继续用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。f．漂洗胚胎，去掉PBS。继续用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。f．漂洗胚胎，去掉PBS。继续用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。f．漂洗胚胎，去掉PBS。继续用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。f．漂洗胚胎，去掉．漂洗胚胎，去掉PBSPBS。继续用。继续用PBSPBS漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。

2)将1－2个胚胎转移至一个小的无菌培养皿中，用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎， 用PBS漂洗。2)将1－2个胚胎转移至一个小的无菌培养皿中，用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎， 用PBS漂洗。2)将1－2个胚胎转移至一个小的无菌培养皿中，用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎， 用PBS漂洗。2)将1－2个胚胎转移至一个小的无菌培养皿中，用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎， 用PBS漂洗。2)将将11－－22个胚胎转移至一个小的无菌培养皿中，用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎， 用个胚胎转移至一个小的无菌培养皿中，用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎， 用PBSPBS漂洗。漂洗。
3)在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一50ml 的无菌离心筒中, 加入40ml 0.25％的无菌胰蛋白酶,用搅拌棒轻轻搅动 。3)在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一50ml 的无菌离心筒中, 加入40ml 0.25％的无菌胰蛋白酶,用搅拌棒轻轻搅动 。3)在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一50ml 的无菌离心筒中, 加入40ml 0.25％的无菌胰蛋白酶,用搅拌棒轻轻搅动 。3)在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一50ml 的无菌离心筒中, 加入40ml 0.25％的无菌胰蛋白酶,用搅拌棒轻轻搅动 。3)在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一50ml 50ml 的无菌离心筒中的无菌离心筒中, , 加入加入40ml 0.2540ml 0.25％的无菌胰蛋白酶％的无菌胰蛋白酶,,用搅拌棒轻轻搅动 。用搅拌棒轻轻搅动 。
4)在温暖的环境中或置于37 °C培养箱中轻轻摇动15分钟。4)在温暖的环境中或置于37 °C培养箱中轻轻摇动15分钟。4)在温暖的环境中或置于37 °C培养箱中轻轻摇动15分钟。4)在温暖的环境中或置于37 °C培养箱中轻轻摇动15分钟。4)在温暖的环境中或置于在温暖的环境中或置于37 37 °°CC培养箱中轻轻摇动培养箱中轻轻摇动1515分钟。分钟。
5)让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中，该管内按照每10ml上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活,胰蛋白酶。5)让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中，该管内按照每10ml上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活,胰蛋白酶。5)让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中，该管内按照每10ml上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活,胰蛋白酶。5)让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中，该管内按照每10ml上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活,胰蛋白酶。5)让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml50ml的离心管中，该管内按照每的离心管中，该管内按照每10ml10ml上清加入上清加入l mll ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活小牛血清的比例加入牛血清以灭活,,胰蛋白酶。胰蛋白酶。

6)加人新鲜胰蛋白酶溶液(见前述步骤)于含有残留未消化组织块的原来的50ml离心筒中，重复步骤4和5。6)加人新鲜胰蛋白酶溶液(见前述步骤)于含有残留未消化组织块的原来的50ml离心筒中，重复步骤4和5。6)加人新鲜胰蛋白酶溶液(见前述步骤)于含有残留未消化组织块的原来的50ml离心筒中，重复步骤4和5。6)加人新鲜胰蛋白酶溶液(见前述步骤)于含有残留未消化组织块的原来的50ml离心筒中，重复步骤4和5。6)加人新鲜胰蛋白酶溶液加人新鲜胰蛋白酶溶液((见前述步骤见前述步骤))于含有残留未消化组织块的原来的于含有残留未消化组织块的原来的50ml50ml离心筒中，重复步骤离心筒中，重复步骤44和和55。。
7)离心混合的细胞悬液，1200r/rain，5分钟，弃上清。7)离心混合的细胞悬液，1200r/rain，5分钟，弃上清。7)离心混合的细胞悬液，1200r/rain，5分钟，弃上清。7)离心混合的细胞悬液，1200r/rain，5分钟，弃上清。7)离心混合的细胞悬液，离心混合的细胞悬液，1200r/rain1200r/rain，，55分钟，弃上清。分钟，弃上清。
8)用新鲜的无菌PBS重悬沉淀的细胞，按步骤7再次离心。8)用新鲜的无菌PBS重悬沉淀的细胞，按步骤7再次离心。8)用新鲜的无菌PBS重悬沉淀的细胞，按步骤7再次离心。8)用新鲜的无菌PBS重悬沉淀的细胞，按步骤7再次离心。8)用新鲜的无菌用新鲜的无菌PBSPBS重悬沉淀的细胞，按步骤重悬沉淀的细胞，按步骤77再次离心。再次离心。
9)用PBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止。9)用PBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止。9)用PBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止。9)用PBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止。9)用用PBSPBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止。反复洗涤细胞直至上清清亮为止。大鼠羊膜间质细胞/大鼠羊膜间质细胞/大鼠羊膜间质细胞大鼠羊膜间质细胞/大鼠羊膜间质细胞/大鼠羊膜间质细胞大鼠羊膜间质细胞/大鼠羊膜间质细胞/大鼠羊膜间质细胞大鼠羊膜间质细胞/大鼠羊膜间质细胞/大鼠羊膜间质细胞大鼠羊膜间质细胞大鼠羊膜间质细胞/大鼠羊膜间质细胞大鼠羊膜间质细胞//大鼠羊膜间质细胞大鼠羊膜间质细胞


一、组织块直接培养法一、组织块直接培养法一、组织块直接培养法一、组织块直接培养法一、组织块直接培养法一、组织块直接培养法

1、取材，用Hank's液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。1、取材，用Hank's液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。1、取材，用Hank's液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。1、取材，用Hank's液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。1、取材，用、取材，用Hank'sHank's液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。

2、用手术剪将组织剪切成1mm3 左右的小块，再用Hank's液洗三次。2、用手术剪将组织剪切成1mm3 左右的小块，再用Hank's液洗三次。2、用手术剪将组织剪切成1mm3 左右的小块，再用Hank's液洗三次。2、用手术剪将组织剪切成1mm3 左右的小块，再用Hank's液洗三次。2、用手术剪将组织剪切成、用手术剪将组织剪切成1mm3 1mm3 左右的小块，再用左右的小块，再用Hank'sHank's液洗三次。液洗三次。

3、将组织块转移至培养瓶，并贴附于瓶底面。3、将组织块转移至培养瓶，并贴附于瓶底面。3、将组织块转移至培养瓶，并贴附于瓶底面。3、将组织块转移至培养瓶，并贴附于瓶底面。3、将组织块转移至培养瓶，并贴附于瓶底面。、将组织块转移至培养瓶，并贴附于瓶底面。

4、轻轻将培养瓶翻转，瓶底朝上，向瓶内注入适量的培养液，将培养瓶放置在37℃恒温箱内培养。4、轻轻将培养瓶翻转，瓶底朝上，向瓶内注入适量的培养液，将培养瓶放置在37℃恒温箱内培养。4、轻轻将培养瓶翻转，瓶底朝上，向瓶内注入适量的培养液，将培养瓶放置在37℃恒温箱内培养。4、轻轻将培养瓶翻转，瓶底朝上，向瓶内注入适量的培养液，将培养瓶放置在37℃恒温箱内培养。4、轻轻将培养瓶翻转，瓶底朝上，向瓶内注入适量的培养液，将培养瓶放置在、轻轻将培养瓶翻转，瓶底朝上，向瓶内注入适量的培养液，将培养瓶放置在3737℃恒温箱内培养。℃恒温箱内培养。

5、放置待组织小块贴附后，将培养瓶慢慢翻转平放，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。5、放置待组织小块贴附后，将培养瓶慢慢翻转平放，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。5、放置待组织小块贴附后，将培养瓶慢慢翻转平放，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。5、放置待组织小块贴附后，将培养瓶慢慢翻转平放，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。5、放置待组织小块贴附后，将培养瓶慢慢翻转平放，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），、放置待组织小块贴附后，将培养瓶慢慢翻转平放，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），3737℃继续培养。℃继续培养。

二、消化培养法二、消化培养法二、消化培养法二、消化培养法二、消化培养法二、消化培养法

1、取材，用Hank's液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。1、取材，用Hank's液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。1、取材，用Hank's液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。1、取材，用Hank's液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。1、取材，用、取材，用Hank'sHank's液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。

2、用手术剪将组织剪切成1mm3 左右的小块，再用Hank's液洗三次。2、用手术剪将组织剪切成1mm3 左右的小块，再用Hank's液洗三次。2、用手术剪将组织剪切成1mm3 左右的小块，再用Hank's液洗三次。2、用手术剪将组织剪切成1mm3 左右的小块，再用Hank's液洗三次。2、用手术剪将组织剪切成、用手术剪将组织剪切成1mm3 1mm3 左右的小块，再用左右的小块，再用Hank'sHank's液洗三次。液洗三次。

3、视组织块量加入酶液，37℃中消化20—40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。3、视组织块量加入酶液，37℃中消化20—40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。3、视组织块量加入酶液，37℃中消化20—40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。3、视组织块量加入酶液，37℃中消化20—40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。3、视组织块量加入酶液，、视组织块量加入酶液，3737℃中消化℃中消化2020——4040分钟，每隔分钟，每隔55分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。

4、加入3—5ml培养液以终止酶消化作用（或加入相关酶抑制剂）。4、加入3—5ml培养液以终止酶消化作用（或加入相关酶抑制剂）。4、加入3—5ml培养液以终止酶消化作用（或加入相关酶抑制剂）。4、加入3—5ml培养液以终止酶消化作用（或加入相关酶抑制剂）。4、加入、加入33——5ml5ml培养液以终止酶消化作用（或加入相关酶抑制剂）。培养液以终止酶消化作用（或加入相关酶抑制剂）。

5、静置5—10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。5、静置5—10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。5、静置5—10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。5、静置5—10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。5、静置、静置55——1010分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。

6、1000rpm，离心10分钟，弃上清液。6、1000rpm，离心10分钟，弃上清液。6、1000rpm，离心10分钟，弃上清液。6、1000rpm，离心10分钟，弃上清液。6、、1000rpm1000rpm，离心，离心1010分钟，弃上清液。分钟，弃上清液。

7、加入Hank's液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。7、加入Hank's液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。7、加入Hank's液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。7、加入Hank's液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。7、加入、加入Hank'sHank's液液5ml5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。

8、加入培养液1—2ml（视细胞量），血球计数板计数。8、加入培养液1—2ml（视细胞量），血球计数板计数。8、加入培养液1—2ml（视细胞量），血球计数板计数。8、加入培养液1—2ml（视细胞量），血球计数板计数。8、加入培养液、加入培养液11——2ml2ml（视细胞量），血球计数板计数。（视细胞量），血球计数板计数。

9、将细胞转移到培养瓶中，37℃下培养。9、将细胞转移到培养瓶中，37℃下培养。9、将细胞转移到培养瓶中，37℃下培养。9、将细胞转移到培养瓶中，37℃下培养。9、将细胞转移到培养瓶中，、将细胞转移到培养瓶中，3737℃下培养。℃下培养。

大鼠羊膜间质细胞/大鼠羊膜间质细胞/大鼠羊膜间质细胞大鼠羊膜间质细胞/大鼠羊膜间质细胞/大鼠羊膜间质细胞大鼠羊膜间质细胞/大鼠羊膜间质细胞/大鼠羊膜间质细胞大鼠羊膜间质细胞/大鼠羊膜间质细胞/大鼠羊膜间质细胞大鼠羊膜间质细胞大鼠羊膜间质细胞/大鼠羊膜间质细胞大鼠羊膜间质细胞//大鼠羊膜间质细胞大鼠羊膜间质细胞

三、器官培养三、器官培养三、器官培养三、器官培养三、三、 器官培养器官培养

1、将不锈网做成支架形状，调整其高度至培养皿的1/2深度平面，在其表面放置0.5μm孔径滤膜。1、将不锈网做成支架形状，调整其高度至培养皿的1/2深度平面，在其表面放置0.5μm孔径滤膜。1、将不锈网做成支架形状，调整其高度至培养皿的1/2深度平面，在其表面放置0.5μm孔径滤膜。1、将不锈网做成支架形状，调整其高度至培养皿的1/2深度平面，在其表面放置0.5μm孔径滤膜。1、将不锈网做成支架形状，调整其高度至培养皿的、将不锈网做成支架形状，调整其高度至培养皿的1/21/2深度平面，在其表面放置深度平面，在其表面放置0.50.5μμmm孔径滤膜。孔径滤膜。

2、将培养液加入培养皿中，使液面刚刚接触到滤膜，但不要使其浮起。2、将培养液加入培养皿中，使液面刚刚接触到滤膜，但不要使其浮起。2、将培养液加入培养皿中，使液面刚刚接触到滤膜，但不要使其浮起。2、将培养液加入培养皿中，使液面刚刚接触到滤膜，但不要使其浮起。2、将培养液加入培养皿中，使液面刚刚接触到滤膜，但不要使其浮起。、将培养液加入培养皿中，使液面刚刚接触到滤膜，但不要使其浮起。

3、将要培养器官组织放在滤膜上，一般厚度不要超过200μm，水平面积不超过10mm2 。3、将要培养器官组织放在滤膜上，一般厚度不要超过200μm，水平面积不超过10mm2 。3、将要培养器官组织放在滤膜上，一般厚度不要超过200μm，水平面积不超过10mm2 。3、将要培养器官组织放在滤膜上，一般厚度不要超过200μm，水平面积不超过10mm2 。3、将要培养器官组织放在滤膜上，一般厚度不要超过、将要培养器官组织放在滤膜上，一般厚度不要超过200200μμmm，水平面积不超过，水平面积不超过10mm2 10mm2 。。

4、将上述准备好的培养物放入CO2 培养箱，并加注氧气调整氧分压，最好到90%。4、将上述准备好的培养物放入CO2 培养箱，并加注氧气调整氧分压，最好到90%。4、将上述准备好的培养物放入CO2 培养箱，并加注氧气调整氧分压，最好到90%。4、将上述准备好的培养物放入CO2 培养箱，并加注氧气调整氧分压，最好到90%。4、将上述准备好的培养物放入、将上述准备好的培养物放入CO2 CO2 培养箱，并加注氧气调整氧分压，最好到培养箱，并加注氧气调整氧分压，最好到90%90%。。

5、培养过程中要注意观察培养液平面，尽可能保持在与滤膜一致的水平上。5、培养过程中要注意观察培养液平面，尽可能保持在与滤膜一致的水平上。5、培养过程中要注意观察培养液平面，尽可能保持在与滤膜一致的水平上。5、培养过程中要注意观察培养液平面，尽可能保持在与滤膜一致的水平上。5、培养过程中要注意观察培养液平面，尽可能保持在与滤膜一致的水平上。、培养过程中要注意观察培养液平面，尽可能保持在与滤膜一致的水平上。

6、上述可进行器官培养1-3周，每2-3天换液一次，并根据情况做进一步实验和检测。6、上述可进行器官培养1-3周，每2-3天换液一次，并根据情况做进一步实验和检测。6、上述可进行器官培养1-3周，每2-3天换液一次，并根据情况做进一步实验和检测。6、上述可进行器官培养1-3周，每2-3天换液一次，并根据情况做进一步实验和检测。6、上述可进行器官培养、上述可进行器官培养1-31-3周，每周，每2-32-3天换液一次，并根据情况做进一步实验和检测。天换液一次，并根据情况做进一步实验和检测。