大鼠羊膜间质/羊膜间质/羊膜间质细胞

FCM数据的存贮的方式是FCS2.0（flow cytometry standard），采用列表排队(List Mode)方式。易于加工处理分析，但缺乏直观性，数据的显示通常有一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等几种；由数据还可以做出标准曲线进行定量分析。

Q1：坐标轴的意义？
1、 单参数直方图
每一个细胞单参数的测量数据可以整理成统计分布，以直方图的方式来显示。在图中，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，其单位是道数（channel），可以是线形（line）或者对数（log）。纵坐标一般是相对细胞/粒子数（count）！

2、 二维图
在二维图的中，横坐标/纵坐标都表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，可以是线形（line）或者对数（log）。双参数图可以将样品细胞群分开，从而方便对感兴趣的细胞进行分析。

Q2：“Gate”和 “Regin”？
设门是流式细胞分析中一种重要的技术，只有通过最佳的设门方式，才能准确地获取和分析数据，从而得到临床诊断和科研中有价值的信息。

On-line gating(threshold gating)监测/获取数据
Off-line gating： 分析实验数据 散射光设门/荧光设门 散射光/荧光联合设门

多重逻辑门(组合门)多重逻辑门 G3=R1 and R2 (G3=R1×R2)

其它： G=R1 or R2 G=R1 not R2Q3:流式图中的颜色与荧光颜色?

流式图中的颜色为区分不同细胞群而人为指定, 与荧光颜色无关!!

Q4：流式图中的阴/阳（N/P）如何划分?
如何做M1阴性界限？实际上，这个M1的划分完全是根据阴性(同型)对照来的！如下图：左图为同型对照，即：您所检测的物质在阴性组中的基础表达量，可以理解为背景、静息状态下、基础水平、未受刺激时等。右图即阳性组，也就是接受刺激后，功能状态下、药物作用后等。
Q5: 这么巧，阴性正好在101划分？？
其实, 我们可以人为地将电压，放大倍数调到相应的大小，使阴性的右边界在某一个值上，（通常划在101附近）这样后期做sample时好看！当然也可以调到102，103次方。

Q6：为什么要进行荧光补偿？
流式细胞分析中经常要用到2种以上的荧光标记抗体进行染色，而目前所使用的多种荧光染料发射谱间有一定重叠。

FCM数据的存贮的方式是FCS2.0（flow cytometry standard），采用列表排队(List Mode)方式。易于加工处理分析，但缺乏直观性，数据的显示通常有一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等几种；由数据还可以做出标准曲线进行定量分析。FCM数据的存贮的方式是FCS2.0（flow cytometry standard），采用列表排队(List Mode)方式。易于加工处理分析，但缺乏直观性，数据的显示通常有一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等几种；由数据还可以做出标准曲线进行定量分析。FCM数据的存贮的方式是FCS2.0（flow cytometry standard），采用列表排队(List Mode)方式。易于加工处理分析，但缺乏直观性，数据的显示通常有一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等几种；由数据还可以做出标准曲线进行定量分析。FCM数据的存贮的方式是FCS2.0（flow cytometry standard），采用列表排队(List Mode)方式。易于加工处理分析，但缺乏直观性，数据的显示通常有一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等几种；由数据还可以做出标准曲线进行定量分析。FCM数据的存贮的方式是数据的存贮的方式是FCS2.0FCS2.0（（flow cytometry standardflow cytometry standard），采用列表排队），采用列表排队(List Mode)(List Mode)方式。易于加工处理分析，但缺乏直观性，数据的显示通常有一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等几种；由数据还可以做出标准曲线进行定量分析。方式。易于加工处理分析，但缺乏直观性，数据的显示通常有一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等几种；由数据还可以做出标准曲线进行定量分析。

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1、 单参数直方图1、 单参数直方图1、 单参数直方图1、 单参数直方图1、 单参数直方图、 单参数直方图
每一个细胞单参数的测量数据可以整理成统计分布，以直方图的方式来显示。在图中，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，其单位是道数（channel），可以是线形（line）或者对数（log）。纵坐标一般是相对细胞/粒子数（count）！每一个细胞单参数的测量数据可以整理成统计分布，以直方图的方式来显示。在图中，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，其单位是道数（channel），可以是线形（line）或者对数（log）。纵坐标一般是相对细胞/粒子数（count）！每一个细胞单参数的测量数据可以整理成统计分布，以直方图的方式来显示。在图中，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，其单位是道数（channel），可以是线形（line）或者对数（log）。纵坐标一般是相对细胞/粒子数（count）！每一个细胞单参数的测量数据可以整理成统计分布，以直方图的方式来显示。在图中，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，其单位是道数（channel），可以是线形（line）或者对数（log）。纵坐标一般是相对细胞/粒子数（count）！每一个细胞单参数的测量数据可以整理成统计分布，以直方图的方式来显示。在图中，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，其单位是道数（每一个细胞单参数的测量数据可以整理成统计分布，以直方图的方式来显示。在图中，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，其单位是道数（channel），可以是线形（），可以是线形（lineline）或者对数（）或者对数（loglog）。纵坐标一般是相对细胞）。纵坐标一般是相对细胞//粒子数（粒子数（countcount）！）！

2、 二维图2、 二维图2、 二维图2、 二维图2、 二维图、 二维图
在二维图的中，横坐标/纵坐标都表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，可以是线形（line）或者对数（log）。双参数图可以将样品细胞群分开，从而方便对感兴趣的细胞进行分析。在二维图的中，横坐标/纵坐标都表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，可以是线形（line）或者对数（log）。双参数图可以将样品细胞群分开，从而方便对感兴趣的细胞进行分析。在二维图的中，横坐标/纵坐标都表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，可以是线形（line）或者对数（log）。双参数图可以将样品细胞群分开，从而方便对感兴趣的细胞进行分析。在二维图的中，横坐标/纵坐标都表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，可以是线形（line）或者对数（log）。双参数图可以将样品细胞群分开，从而方便对感兴趣的细胞进行分析。在二维图的中，横坐标在二维图的中，横坐标/纵坐标都表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，可以是线形（纵坐标都表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，可以是线形（lineline）或者对数（）或者对数（loglog）。双参数图可以将样品细胞群分开，从而方便对感兴趣的细胞进行分析。）。双参数图可以将样品细胞群分开，从而方便对感兴趣的细胞进行分析。

Q2：“Gate”和 “Regin”？Q2：“Gate”和 “Regin”？Q2：“Gate”和 “Regin”？Q2：“Gate”和 “Regin”？Q2：“：“GateGate”和 “”和 “ReginRegin”？”？
设门是流式细胞分析中一种重要的技术，只有通过最佳的设门方式，才能准确地获取和分析数据，从而得到临床诊断和科研中有价值的信息。设门是流式细胞分析中一种重要的技术，只有通过最佳的设门方式，才能准确地获取和分析数据，从而得到临床诊断和科研中有价值的信息。设门是流式细胞分析中一种重要的技术，只有通过最佳的设门方式，才能准确地获取和分析数据，从而得到临床诊断和科研中有价值的信息。设门是流式细胞分析中一种重要的技术，只有通过最佳的设门方式，才能准确地获取和分析数据，从而得到临床诊断和科研中有价值的信息。设门是流式细胞分析中一种重要的技术，只有通过最佳的设门方式，才能准确地获取和分析数据，从而得到临床诊断和科研中有价值的信息。设门是流式细胞分析中一种重要的技术，只有通过最佳的设门方式，才能准确地获取和分析数据，从而得到临床诊断和科研中有价值的信息。

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多重逻辑门(组合门)多重逻辑门 G3=R1 and R2 (G3=R1×R2)多重逻辑门(组合门)多重逻辑门 G3=R1 and R2 (G3=R1×R2)多重逻辑门(组合门)多重逻辑门 G3=R1 and R2 (G3=R1×R2)多重逻辑门(组合门)多重逻辑门 G3=R1 and R2 (G3=R1×R2)多重逻辑门多重逻辑门(组合门组合门))多重逻辑门 多重逻辑门 G3=R1 and R2 (G3=R1G3=R1 and R2 (G3=R1××R2)R2)

其它： G=R1 or R2 G=R1 not R2Q3:流式图中的颜色与荧光颜色?其它： G=R1 or R2 G=R1 not R2Q3:流式图中的颜色与荧光颜色?其它： G=R1 or R2 G=R1 not R2Q3:流式图中的颜色与荧光颜色?其它： G=R1 or R2 G=R1 not R2Q3:流式图中的颜色与荧光颜色?其它：其它： G=R1 or R2 G=R1 not R2Q3:流式图中的颜色与荧光颜色流式图中的颜色与荧光颜色??

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其实, 我们可以人为地将电压，放大倍数调到相应的大小，使阴性的右边界在某一个值上，（通常划在101附近）这样后期做sample时好看！当然也可以调到102，103次方。其实, 我们可以人为地将电压，放大倍数调到相应的大小，使阴性的右边界在某一个值上，（通常划在101附近）这样后期做sample时好看！当然也可以调到102，103次方。其实, 我们可以人为地将电压，放大倍数调到相应的大小，使阴性的右边界在某一个值上，（通常划在101附近）这样后期做sample时好看！当然也可以调到102，103次方。其实, 我们可以人为地将电压，放大倍数调到相应的大小，使阴性的右边界在某一个值上，（通常划在101附近）这样后期做sample时好看！当然也可以调到102，103次方。其实其实, 我们可以人为地将电压，放大倍数调到相应的大小，使阴性的右边界在某一个值上，（通常划在我们可以人为地将电压，放大倍数调到相应的大小，使阴性的右边界在某一个值上，（通常划在101101附近）这样后期做附近）这样后期做samplesample时好看！当然也可以调到时好看！当然也可以调到102102，，103103次方。次方。

Q6：为什么要进行荧光补偿？Q6：为什么要进行荧光补偿？Q6：为什么要进行荧光补偿？Q6：为什么要进行荧光补偿？Q6：为什么要进行荧光补偿？：为什么要进行荧光补偿？
流式细胞分析中经常要用到2种以上的荧光标记抗体进行染色，而目前所使用的多种荧光染料发射谱间有一定重叠。流式细胞分析中经常要用到2种以上的荧光标记抗体进行染色，而目前所使用的多种荧光染料发射谱间有一定重叠。流式细胞分析中经常要用到2种以上的荧光标记抗体进行染色，而目前所使用的多种荧光染料发射谱间有一定重叠。流式细胞分析中经常要用到2种以上的荧光标记抗体进行染色，而目前所使用的多种荧光染料发射谱间有一定重叠。流式细胞分析中经常要用到流式细胞分析中经常要用到2种以上的荧光标记抗体进行染色，而目前所使用的多种荧光染料发射谱间有一定重叠。种以上的荧光标记抗体进行染色，而目前所使用的多种荧光染料发射谱间有一定重叠。
 大鼠羊膜间质/羊膜间质/羊膜间质细胞

“荧光补偿”这个术语是指修正荧光渗漏的过程，如从探测器除去除匹配荧光以外的任何荧光信号。

MTT法实验步骤

1: 胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5-10×104/ml。

细胞详细计数方法请参照易生物实验技术中的相关文章。对于初学者而言，要使细胞达到5-10×104/ml往往不知从何处着手，我在这里向大家提供一个简单的方法以初步确定细胞数量。

以一般细胞培养常用的25cm2为例，

1)细胞密度在长到约80%~90%(下图所示为80%~90%密度时细胞的大致状态)，消化离心收集后，将上清去掉，加入3ml培养基使其混匀。

2)另取一支新的15ml无菌离心管(为下一步接种96孔板用)，装入约9ml培养基.

3)从第一步准备的3ml细胞悬液中取1ml, 加入上管，混匀后细胞计数，此时一般为或小于5-10×104/ml，该浓度相当于细胞计数板4个大格内每大格平均5-10个细胞(见下图);如果不够该浓度，再根据计数的结果滴加细胞悬液，每滴按50ul计算。

4)细胞数量因实验目的不同应做相应调整，如一般细胞增殖实验每孔2000个就可以(相当于细胞悬液密度为2×104/ml)，细胞毒性实验每孔5000—10000个(相当于细胞悬液密度为5×104/ml)。此外，还应根据细胞本身特性，如生长快慢，来决定细胞数量。比如：生长较快的细胞密度可略小。

2.将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入100ul, 这样待测细胞的密度为5000—10000/孔(边缘孔用无菌PBS填充)。

注意：因细胞在混匀后仍要继续沉降，因此接种的过程中要反复多次混匀，如每加6个孔就混匀一次，以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同，这对于MTT的结果至关重要。

3.将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设6个，否则难以反应真实情况。下图可做为96孔板的的参考步局。

对于加药，有人直接将药物按不同体积加入到96孔板中，以形成浓度梯度。但本人认为应尽量在EP管中将不同浓度的药物配好，然后将96孔板中的培养上清去掉(可以用排枪吸走)再加入100ul含不同浓度药物的培养基，这样能保证药物浓度的准确。另外，需注意的是，如果用这种方法，不要把96孔板的培养液全部吸走后再加药，应该吸完一部分后立即加样，避免由于96孔板干燥引起细胞死亡。

4.5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察药物的作用效果。下图为一典型的药物梯度为细胞的毒性作用。

5.每孔加入10ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液

6. 终止培养，准备溶解结晶。

“荧光补偿”这个术语是指修正荧光渗漏的过程，如从探测器除去除匹配荧光以外的任何荧光信号。“荧光补偿”这个术语是指修正荧光渗漏的过程，如从探测器除去除匹配荧光以外的任何荧光信号。“荧光补偿”这个术语是指修正荧光渗漏的过程，如从探测器除去除匹配荧光以外的任何荧光信号。“荧光补偿”这个术语是指修正荧光渗漏的过程，如从探测器除去除匹配荧光以外的任何荧光信号。“荧光补偿”这个术语是指修正荧光渗漏的过程，如从探测器除去除匹配荧光以外的任何荧光信号。

MTT法实验步骤
MTT法实验步骤
MTT法实验步骤
MTT法实验步骤
MTT法实验步骤法实验步骤

1: 胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5-10×104/ml。1: 胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5-10×104/ml。1: 胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5-10×104/ml。1: 胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5-10×104/ml。1: 胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5-105-10××104/ml104/ml。。

细胞详细计数方法请参照易生物实验技术中的相关文章。对于初学者而言，要使细胞达到5-10×104/ml往往不知从何处着手，我在这里向大家提供一个简单的方法以初步确定细胞数量。细胞详细计数方法请参照易生物实验技术中的相关文章。对于初学者而言，要使细胞达到5-10×104/ml往往不知从何处着手，我在这里向大家提供一个简单的方法以初步确定细胞数量。细胞详细计数方法请参照易生物实验技术中的相关文章。对于初学者而言，要使细胞达到5-10×104/ml往往不知从何处着手，我在这里向大家提供一个简单的方法以初步确定细胞数量。细胞详细计数方法请参照易生物实验技术中的相关文章。对于初学者而言，要使细胞达到5-10×104/ml往往不知从何处着手，我在这里向大家提供一个简单的方法以初步确定细胞数量。细胞详细计数方法请参照易生物实验技术中的相关文章。对于初学者而言，要使细胞达到细胞详细计数方法请参照易生物实验技术中的相关文章。对于初学者而言，要使细胞达到5-10××104/ml104/ml往往不知从何处着手，我在这里向大家提供一个简单的方法以初步确定细胞数量。往往不知从何处着手，我在这里向大家提供一个简单的方法以初步确定细胞数量。

以一般细胞培养常用的25cm2为例，以一般细胞培养常用的25cm2为例，以一般细胞培养常用的25cm2为例，以一般细胞培养常用的25cm2为例，以一般细胞培养常用的以一般细胞培养常用的25cm2为例，为例，

1)细胞密度在长到约80%~90%(下图所示为80%~90%密度时细胞的大致状态)，消化离心收集后，将上清去掉，加入3ml培养基使其混匀。1)细胞密度在长到约80%~90%(下图所示为80%~90%密度时细胞的大致状态)，消化离心收集后，将上清去掉，加入3ml培养基使其混匀。1)细胞密度在长到约80%~90%(下图所示为80%~90%密度时细胞的大致状态)，消化离心收集后，将上清去掉，加入3ml培养基使其混匀。1)细胞密度在长到约80%~90%(下图所示为80%~90%密度时细胞的大致状态)，消化离心收集后，将上清去掉，加入3ml培养基使其混匀。1)细胞密度在长到约细胞密度在长到约80%~90%(80%~90%(下图所示为下图所示为80%~90%80%~90%密度时细胞的大致状态密度时细胞的大致状态))，消化离心收集后，将上清去掉，加入，消化离心收集后，将上清去掉，加入3ml3ml培养基使其混匀。培养基使其混匀。

2)另取一支新的15ml无菌离心管(为下一步接种96孔板用)，装入约9ml培养基.2)另取一支新的15ml无菌离心管(为下一步接种96孔板用)，装入约9ml培养基.2)另取一支新的15ml无菌离心管(为下一步接种96孔板用)，装入约9ml培养基.2)另取一支新的15ml无菌离心管(为下一步接种96孔板用)，装入约9ml培养基.2)另取一支新的另取一支新的15ml15ml无菌离心管无菌离心管((为下一步接种为下一步接种9696孔板用孔板用))，装入约，装入约9ml9ml培养基培养基..

3)从第一步准备的3ml细胞悬液中取1ml, 加入上管，混匀后细胞计数，此时一般为或小于5-10×104/ml，该浓度相当于细胞计数板4个大格内每大格平均5-10个细胞(见下图);如果不够该浓度，再根据计数的结果滴加细胞悬液，每滴按50ul计算。3)从第一步准备的3ml细胞悬液中取1ml, 加入上管，混匀后细胞计数，此时一般为或小于5-10×104/ml，该浓度相当于细胞计数板4个大格内每大格平均5-10个细胞(见下图);如果不够该浓度，再根据计数的结果滴加细胞悬液，每滴按50ul计算。3)从第一步准备的3ml细胞悬液中取1ml, 加入上管，混匀后细胞计数，此时一般为或小于5-10×104/ml，该浓度相当于细胞计数板4个大格内每大格平均5-10个细胞(见下图);如果不够该浓度，再根据计数的结果滴加细胞悬液，每滴按50ul计算。3)从第一步准备的3ml细胞悬液中取1ml, 加入上管，混匀后细胞计数，此时一般为或小于5-10×104/ml，该浓度相当于细胞计数板4个大格内每大格平均5-10个细胞(见下图);如果不够该浓度，再根据计数的结果滴加细胞悬液，每滴按50ul计算。3)从第一步准备的从第一步准备的3ml3ml细胞悬液中取细胞悬液中取1ml, 1ml, 加入上管，混匀后细胞计数，此时一般为或小于加入上管，混匀后细胞计数，此时一般为或小于5-105-10××104/ml104/ml，该浓度相当于细胞计数板，该浓度相当于细胞计数板44个大格内每大格平均个大格内每大格平均5-105-10个细胞个细胞((见下图见下图););如果不够该浓度，再根据计数的结果滴加细胞悬液，每滴按如果不够该浓度，再根据计数的结果滴加细胞悬液，每滴按50ul50ul计算。计算。

4)细胞数量因实验目的不同应做相应调整，如一般细胞增殖实验每孔2000个就可以(相当于细胞悬液密度为2×104/ml)，细胞毒性实验每孔5000—10000个(相当于细胞悬液密度为5×104/ml)。此外，还应根据细胞本身特性，如生长快慢，来决定细胞数量。比如：生长较快的细胞密度可略小。4)细胞数量因实验目的不同应做相应调整，如一般细胞增殖实验每孔2000个就可以(相当于细胞悬液密度为2×104/ml)，细胞毒性实验每孔5000—10000个(相当于细胞悬液密度为5×104/ml)。此外，还应根据细胞本身特性，如生长快慢，来决定细胞数量。比如：生长较快的细胞密度可略小。4)细胞数量因实验目的不同应做相应调整，如一般细胞增殖实验每孔2000个就可以(相当于细胞悬液密度为2×104/ml)，细胞毒性实验每孔5000—10000个(相当于细胞悬液密度为5×104/ml)。此外，还应根据细胞本身特性，如生长快慢，来决定细胞数量。比如：生长较快的细胞密度可略小。4)细胞数量因实验目的不同应做相应调整，如一般细胞增殖实验每孔2000个就可以(相当于细胞悬液密度为2×104/ml)，细胞毒性实验每孔5000—10000个(相当于细胞悬液密度为5×104/ml)。此外，还应根据细胞本身特性，如生长快慢，来决定细胞数量。比如：生长较快的细胞密度可略小。4)细胞数量因实验目的不同应做相应调整，如一般细胞增殖实验每孔细胞数量因实验目的不同应做相应调整，如一般细胞增殖实验每孔20002000个就可以个就可以((相当于细胞悬液密度为相当于细胞悬液密度为22××104/ml)104/ml)，细胞毒性实验每孔，细胞毒性实验每孔50005000——1000010000个个((相当于细胞悬液密度为相当于细胞悬液密度为55××104/ml)104/ml)。此外，还应根据细胞本身特性，如生长快慢，来决定细胞数量。比如：生长较快的细胞密度可略小。。此外，还应根据细胞本身特性，如生长快慢，来决定细胞数量。比如：生长较快的细胞密度可略小。

2.将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入100ul, 这样待测细胞的密度为5000—10000/孔(边缘孔用无菌PBS填充)。2.将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入100ul, 这样待测细胞的密度为5000—10000/孔(边缘孔用无菌PBS填充)。2.将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入100ul, 这样待测细胞的密度为5000—10000/孔(边缘孔用无菌PBS填充)。2.将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入100ul, 这样待测细胞的密度为5000—10000/孔(边缘孔用无菌PBS填充)。2.将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入100ul, 100ul, 这样待测细胞的密度为这样待测细胞的密度为50005000——10000/10000/孔孔((边缘孔用无菌边缘孔用无菌PBSPBS填充填充))。。

注意：因细胞在混匀后仍要继续沉降，因此接种的过程中要反复多次混匀，如每加6个孔就混匀一次，以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同，这对于MTT的结果至关重要。注意：因细胞在混匀后仍要继续沉降，因此接种的过程中要反复多次混匀，如每加6个孔就混匀一次，以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同，这对于MTT的结果至关重要。注意：因细胞在混匀后仍要继续沉降，因此接种的过程中要反复多次混匀，如每加6个孔就混匀一次，以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同，这对于MTT的结果至关重要。注意：因细胞在混匀后仍要继续沉降，因此接种的过程中要反复多次混匀，如每加6个孔就混匀一次，以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同，这对于MTT的结果至关重要。注意：因细胞在混匀后仍要继续沉降，因此接种的过程中要反复多次混匀，如每加注意：因细胞在混匀后仍要继续沉降，因此接种的过程中要反复多次混匀，如每加6个孔就混匀一次，以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同，这对于个孔就混匀一次，以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同，这对于MTTMTT的结果至关重要。的结果至关重要。

3.将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设6个，否则难以反应真实情况。下图可做为96孔板的的参考步局。3.将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设6个，否则难以反应真实情况。下图可做为96孔板的的参考步局。3.将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设6个，否则难以反应真实情况。下图可做为96孔板的的参考步局。3.将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设6个，否则难以反应真实情况。下图可做为96孔板的的参考步局。3.将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底(96(96孔平底板孔平底板),),加入浓度梯度的药物加入浓度梯度的药物,,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药..一般一般5-75-7个梯度个梯度,,每孔每孔100ul,100ul,设设3-53-5个复孔个复孔..建议设建议设66个，否则难以反应真实情况。下图可做为个，否则难以反应真实情况。下图可做为9696孔板的的参考步局。孔板的的参考步局。

对于加药，有人直接将药物按不同体积加入到96孔板中，以形成浓度梯度。但本人认为应尽量在EP管中将不同浓度的药物配好，然后将96孔板中的培养上清去掉(可以用排枪吸走)再加入100ul含不同浓度药物的培养基，这样能保证药物浓度的准确。另外，需注意的是，如果用这种方法，不要把96孔板的培养液全部吸走后再加药，应该吸完一部分后立即加样，避免由于96孔板干燥引起细胞死亡。对于加药，有人直接将药物按不同体积加入到96孔板中，以形成浓度梯度。但本人认为应尽量在EP管中将不同浓度的药物配好，然后将96孔板中的培养上清去掉(可以用排枪吸走)再加入100ul含不同浓度药物的培养基，这样能保证药物浓度的准确。另外，需注意的是，如果用这种方法，不要把96孔板的培养液全部吸走后再加药，应该吸完一部分后立即加样，避免由于96孔板干燥引起细胞死亡。对于加药，有人直接将药物按不同体积加入到96孔板中，以形成浓度梯度。但本人认为应尽量在EP管中将不同浓度的药物配好，然后将96孔板中的培养上清去掉(可以用排枪吸走)再加入100ul含不同浓度药物的培养基，这样能保证药物浓度的准确。另外，需注意的是，如果用这种方法，不要把96孔板的培养液全部吸走后再加药，应该吸完一部分后立即加样，避免由于96孔板干燥引起细胞死亡。对于加药，有人直接将药物按不同体积加入到96孔板中，以形成浓度梯度。但本人认为应尽量在EP管中将不同浓度的药物配好，然后将96孔板中的培养上清去掉(可以用排枪吸走)再加入100ul含不同浓度药物的培养基，这样能保证药物浓度的准确。另外，需注意的是，如果用这种方法，不要把96孔板的培养液全部吸走后再加药，应该吸完一部分后立即加样，避免由于96孔板干燥引起细胞死亡。对于加药，有人直接将药物按不同体积加入到对于加药，有人直接将药物按不同体积加入到96孔板中，以形成浓度梯度。但本人认为应尽量在孔板中，以形成浓度梯度。但本人认为应尽量在EPEP管中将不同浓度的药物配好，然后将管中将不同浓度的药物配好，然后将9696孔板中的培养上清去掉孔板中的培养上清去掉((可以用排枪吸走可以用排枪吸走))再加入再加入100ul100ul含不同浓度药物的培养基，这样能保证药物浓度的准确。另外，需注意的是，如果用这种方法，不要把含不同浓度药物的培养基，这样能保证药物浓度的准确。另外，需注意的是，如果用这种方法，不要把9696孔板的培养液全部吸走后再加药，应该吸完一部分后立即加样，避免由于孔板的培养液全部吸走后再加药，应该吸完一部分后立即加样，避免由于9696孔板干燥引起细胞死亡。孔板干燥引起细胞死亡。

4.5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察药物的作用效果。下图为一典型的药物梯度为细胞的毒性作用。4.5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察药物的作用效果。下图为一典型的药物梯度为细胞的毒性作用。4.5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察药物的作用效果。下图为一典型的药物梯度为细胞的毒性作用。4.5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察药物的作用效果。下图为一典型的药物梯度为细胞的毒性作用。4.5%CO2，，3737℃孵育℃孵育16-4816-48小时，倒置显微镜下观察药物的作用效果。下图为一典型的药物梯度为细胞的毒性作用。小时，倒置显微镜下观察药物的作用效果。下图为一典型的药物梯度为细胞的毒性作用。

5.每孔加入10ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液5.每孔加入10ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液5.每孔加入10ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液5.每孔加入10ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液5.每孔加入每孔加入10ulMTT10ulMTT溶液溶液(5mg/ml(5mg/ml，即，即0.5%MTT)0.5%MTT)，继续培养，继续培养4h4h。若药物与。若药物与MTTMTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBSPBS冲冲2-32-3遍后，再加入含遍后，再加入含MTTMTT的培养液的培养液

6. 终止培养，准备溶解结晶。6. 终止培养，准备溶解结晶。6. 终止培养，准备溶解结晶。6. 终止培养，准备溶解结晶。6. 终止培养，准备溶解结晶。终止培养，准备溶解结晶。
 大鼠羊膜间质/羊膜间质/羊膜间质细胞

溶解结晶的方法有两种，第一种，用DMSO溶解

1) MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。将上清去掉，该过程要注意不能把Formazan结晶移走。有人直接用移液器将上清移走，也有人建议先铺几张滤纸在桌面，然后将96孔板轻轻倒置，这样上清便被滤纸吸走，以减少结果的损失。个人认为，这两种方法都有可能导致结晶的损失，从而引起结果的不准确。采用哪种方法，可以自己摸索一下再决定。

2) 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

另一种方法，用三联溶解液(见上面MTT甲瓒溶解液)

1) MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。这种方法细胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul溶解液。(该溶解液因含有SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将SDS结晶全部溶解后再使用。)

2) 放入培养箱中继续孵育4—6小时，镜下观察，待结晶全部溶解后570nm测吸光度。通常37℃孵育4小时左右，紫色结晶会全部溶解。如果紫色结晶较小较少，溶解的时间会短一些。如果紫色结晶较大较多，溶解的时间会长一些。

在实际的操作过程中，往往为了等待4—6小时，使得实验者在下班以后或者晚上来测OD值，给实验者带来了很大的不方便。个人曾经摸索，加入溶解液后过夜再测对OD值基本无影响，但要注意的是一定要避光，不过培养箱关闭后本身就是闭光的，所以加入溶解液后放入培养箱中，第二天上班时再测OD值就可以了。

7、同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。

溶解结晶的方法有两种，第一种，用DMSO溶解溶解结晶的方法有两种，第一种，用DMSO溶解溶解结晶的方法有两种，第一种，用DMSO溶解溶解结晶的方法有两种，第一种，用DMSO溶解溶解结晶的方法有两种，第一种，用溶解结晶的方法有两种，第一种，用DMSO溶解溶解

1) MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。将上清去掉，该过程要注意不能把Formazan结晶移走。有人直接用移液器将上清移走，也有人建议先铺几张滤纸在桌面，然后将96孔板轻轻倒置，这样上清便被滤纸吸走，以减少结果的损失。个人认为，这两种方法都有可能导致结晶的损失，从而引起结果的不准确。采用哪种方法，可以自己摸索一下再决定。1) MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。将上清去掉，该过程要注意不能把Formazan结晶移走。有人直接用移液器将上清移走，也有人建议先铺几张滤纸在桌面，然后将96孔板轻轻倒置，这样上清便被滤纸吸走，以减少结果的损失。个人认为，这两种方法都有可能导致结晶的损失，从而引起结果的不准确。采用哪种方法，可以自己摸索一下再决定。1) MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。将上清去掉，该过程要注意不能把Formazan结晶移走。有人直接用移液器将上清移走，也有人建议先铺几张滤纸在桌面，然后将96孔板轻轻倒置，这样上清便被滤纸吸走，以减少结果的损失。个人认为，这两种方法都有可能导致结晶的损失，从而引起结果的不准确。采用哪种方法，可以自己摸索一下再决定。1) MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。将上清去掉，该过程要注意不能把Formazan结晶移走。有人直接用移液器将上清移走，也有人建议先铺几张滤纸在桌面，然后将96孔板轻轻倒置，这样上清便被滤纸吸走，以减少结果的损失。个人认为，这两种方法都有可能导致结晶的损失，从而引起结果的不准确。采用哪种方法，可以自己摸索一下再决定。1) MTT加入培养加入培养4h4h后，结晶可充分形成。将上清去掉，该过程要注意不能把后，结晶可充分形成。将上清去掉，该过程要注意不能把FormazanFormazan结晶移走。有人直接用移液器将上清移走，也有人建议先铺几张滤纸在桌面，然后将结晶移走。有人直接用移液器将上清移走，也有人建议先铺几张滤纸在桌面，然后将9696孔板轻轻倒置，这样上清便被滤纸吸走，以减少结果的损失。个人认为，这两种方法都有可能导致结晶的损失，从而引起结果的不准确。采用哪种方法，可以自己摸索一下再决定。孔板轻轻倒置，这样上清便被滤纸吸走，以减少结果的损失。个人认为，这两种方法都有可能导致结晶的损失，从而引起结果的不准确。采用哪种方法，可以自己摸索一下再决定。

2) 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。2) 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。2) 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。2) 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。2) 每孔加入每孔加入150ul150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nmOD490nm处测量各孔的吸光值。处测量各孔的吸光值。

另一种方法，用三联溶解液(见上面MTT甲瓒溶解液)另一种方法，用三联溶解液(见上面MTT甲瓒溶解液)另一种方法，用三联溶解液(见上面MTT甲瓒溶解液)另一种方法，用三联溶解液(见上面MTT甲瓒溶解液)另一种方法，用三联溶解液另一种方法，用三联溶解液(见上面见上面MTTMTT甲瓒溶解液甲瓒溶解液))

1) MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。这种方法细胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul溶解液。(该溶解液因含有SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将SDS结晶全部溶解后再使用。)1) MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。这种方法细胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul溶解液。(该溶解液因含有SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将SDS结晶全部溶解后再使用。)1) MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。这种方法细胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul溶解液。(该溶解液因含有SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将SDS结晶全部溶解后再使用。)1) MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。这种方法细胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul溶解液。(该溶解液因含有SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将SDS结晶全部溶解后再使用。)1) MTT加入培养加入培养4h4h后，结晶可充分形成。这种方法细胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入后，结晶可充分形成。这种方法细胞上清可以不用去掉，直接在每孔加入100ul100ul溶解液。溶解液。((该溶解液因含有该溶解液因含有SDSSDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将SDSSDS结晶全部溶解后再使用。结晶全部溶解后再使用。))

2) 放入培养箱中继续孵育4—6小时，镜下观察，待结晶全部溶解后570nm测吸光度。通常37℃孵育4小时左右，紫色结晶会全部溶解。如果紫色结晶较小较少，溶解的时间会短一些。如果紫色结晶较大较多，溶解的时间会长一些。2) 放入培养箱中继续孵育4—6小时，镜下观察，待结晶全部溶解后570nm测吸光度。通常37℃孵育4小时左右，紫色结晶会全部溶解。如果紫色结晶较小较少，溶解的时间会短一些。如果紫色结晶较大较多，溶解的时间会长一些。2) 放入培养箱中继续孵育4—6小时，镜下观察，待结晶全部溶解后570nm测吸光度。通常37℃孵育4小时左右，紫色结晶会全部溶解。如果紫色结晶较小较少，溶解的时间会短一些。如果紫色结晶较大较多，溶解的时间会长一些。2) 放入培养箱中继续孵育4—6小时，镜下观察，待结晶全部溶解后570nm测吸光度。通常37℃孵育4小时左右，紫色结晶会全部溶解。如果紫色结晶较小较少，溶解的时间会短一些。如果紫色结晶较大较多，溶解的时间会长一些。2) 放入培养箱中继续孵育放入培养箱中继续孵育44——66小时，镜下观察，待结晶全部溶解后小时，镜下观察，待结晶全部溶解后570nm570nm测吸光度。通常测吸光度。通常3737℃孵育℃孵育44小时左右，紫色结晶会全部溶解。如果紫色结晶较小较少，溶解的时间会短一些。如果紫色结晶较大较多，溶解的时间会长一些。小时左右，紫色结晶会全部溶解。如果紫色结晶较小较少，溶解的时间会短一些。如果紫色结晶较大较多，溶解的时间会长一些。

在实际的操作过程中，往往为了等待4—6小时，使得实验者在下班以后或者晚上来测OD值，给实验者带来了很大的不方便。个人曾经摸索，加入溶解液后过夜再测对OD值基本无影响，但要注意的是一定要避光，不过培养箱关闭后本身就是闭光的，所以加入溶解液后放入培养箱中，第二天上班时再测OD值就可以了。在实际的操作过程中，往往为了等待4—6小时，使得实验者在下班以后或者晚上来测OD值，给实验者带来了很大的不方便。个人曾经摸索，加入溶解液后过夜再测对OD值基本无影响，但要注意的是一定要避光，不过培养箱关闭后本身就是闭光的，所以加入溶解液后放入培养箱中，第二天上班时再测OD值就可以了。在实际的操作过程中，往往为了等待4—6小时，使得实验者在下班以后或者晚上来测OD值，给实验者带来了很大的不方便。个人曾经摸索，加入溶解液后过夜再测对OD值基本无影响，但要注意的是一定要避光，不过培养箱关闭后本身就是闭光的，所以加入溶解液后放入培养箱中，第二天上班时再测OD值就可以了。在实际的操作过程中，往往为了等待4—6小时，使得实验者在下班以后或者晚上来测OD值，给实验者带来了很大的不方便。个人曾经摸索，加入溶解液后过夜再测对OD值基本无影响，但要注意的是一定要避光，不过培养箱关闭后本身就是闭光的，所以加入溶解液后放入培养箱中，第二天上班时再测OD值就可以了。在实际的操作过程中，往往为了等待在实际的操作过程中，往往为了等待4——66小时，使得实验者在下班以后或者晚上来测小时，使得实验者在下班以后或者晚上来测ODOD值，给实验者带来了很大的不方便。个人曾经摸索，加入溶解液后过夜再测对值，给实验者带来了很大的不方便。个人曾经摸索，加入溶解液后过夜再测对ODOD值基本无影响，但要注意的是一定要避光，不过培养箱关闭后本身就是闭光的，所以加入溶解液后放入培养箱中，第二天上班时再测值基本无影响，但要注意的是一定要避光，不过培养箱关闭后本身就是闭光的，所以加入溶解液后放入培养箱中，第二天上班时再测ODOD值就可以了。值就可以了。

7、同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。7、同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。7、同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。7、同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。7、同时设置调零孔、同时设置调零孔((培养基、培养基、MTTMTT、二甲基亚砜、二甲基亚砜))，对照孔，对照孔((细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTTMTT、二甲基亚砜、二甲基亚砜))。。