【原代细胞】小鼠Ⅱ型肺泡上皮/Ⅱ型肺泡上皮/Ⅱ型肺泡上皮细胞取材的基本要求取材的基本要求取材的基本要求取材的基本要求取材的基本要求取材的基本要求

（1）取材要注意新鲜和保鲜（1）取材要注意新鲜和保鲜（1）取材要注意新鲜和保鲜（1）取材要注意新鲜和保鲜（（11）取材要注意新鲜和保鲜）取材要注意新鲜和保鲜

新鲜组织易于培养成功，取材时应尽量在4~6h内能制作成细胞，尽快入箱培养，若不能即时培养，应将组织浸泡于培养液内，于4℃存放。若组织块较大，应在清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后，切碎于培养液内4℃存放，但时间不能超过24h。对于已切碎的组织或血液、淋巴组织应加入含10%二甲基亚砜 （DMSO） 的培养基，按细胞冻存方式于液氮中冷冻保存。新鲜组织易于培养成功，取材时应尽量在4~6h内能制作成细胞，尽快入箱培养，若不能即时培养，应将组织浸泡于培养液内，于4℃存放。若组织块较大，应在清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后，切碎于培养液内4℃存放，但时间不能超过24h。对于已切碎的组织或血液、淋巴组织应加入含10%二甲基亚砜 （DMSO） 的培养基，按细胞冻存方式于液氮中冷冻保存。新鲜组织易于培养成功，取材时应尽量在4~6h内能制作成细胞，尽快入箱培养，若不能即时培养，应将组织浸泡于培养液内，于4℃存放。若组织块较大，应在清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后，切碎于培养液内4℃存放，但时间不能超过24h。对于已切碎的组织或血液、淋巴组织应加入含10%二甲基亚砜 （DMSO） 的培养基，按细胞冻存方式于液氮中冷冻保存。新鲜组织易于培养成功，取材时应尽量在4~6h内能制作成细胞，尽快入箱培养，若不能即时培养，应将组织浸泡于培养液内，于4℃存放。若组织块较大，应在清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后，切碎于培养液内4℃存放，但时间不能超过24h。对于已切碎的组织或血液、淋巴组织应加入含10%二甲基亚砜 （DMSO） 的培养基，按细胞冻存方式于液氮中冷冻保存。新鲜组织易于培养成功，取材时应尽量在新鲜组织易于培养成功，取材时应尽量在4~6h4~6h内能制作成细胞，尽快入箱培养，若不能即时培养，应将组织浸泡于培养液内，于内能制作成细胞，尽快入箱培养，若不能即时培养，应将组织浸泡于培养液内，于44℃存放。若组织块较大，应在清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后，切碎于培养液内℃存放。若组织块较大，应在清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后，切碎于培养液内44℃存放，但时间不能超过℃存放，但时间不能超过24h24h。对于已切碎的组织或血液、淋巴组织应加入含。对于已切碎的组织或血液、淋巴组织应加入含10%10%二甲基亚砜 （二甲基亚砜 （DMSODMSO） 的培养基，按细胞冻存方式于液氮中冷冻保存。） 的培养基，按细胞冻存方式于液氮中冷冻保存。

（2）取材应严格无菌（2）取材应严格无菌（2）取材应严格无菌（2）取材应严格无菌（（22）取材应严格无菌）取材应严格无菌

所取标本材料应在无菌条件下进行，为了确保无菌，对所取材料若疑有污染的可能，应将所取组织在含高浓度抗菌素（400单位/mL）甚至加入适量的两性霉素B或10%达克宁液的培养液内于4℃下存放2小时以上，再用PBS洗2~3次，以确保所取材料无菌。要用无菌包装的器皿或事先消毒好的带少许培养液（内含400单位/mL抗菌素）的小瓶等便于携带的物品来取材，所取材料应避免接触有毒有害的化学物质，如碘、汞等。所取标本材料应在无菌条件下进行，为了确保无菌，对所取材料若疑有污染的可能，应将所取组织在含高浓度抗菌素（400单位/mL）甚至加入适量的两性霉素B或10%达克宁液的培养液内于4℃下存放2小时以上，再用PBS洗2~3次，以确保所取材料无菌。要用无菌包装的器皿或事先消毒好的带少许培养液（内含400单位/mL抗菌素）的小瓶等便于携带的物品来取材，所取材料应避免接触有毒有害的化学物质，如碘、汞等。所取标本材料应在无菌条件下进行，为了确保无菌，对所取材料若疑有污染的可能，应将所取组织在含高浓度抗菌素（400单位/mL）甚至加入适量的两性霉素B或10%达克宁液的培养液内于4℃下存放2小时以上，再用PBS洗2~3次，以确保所取材料无菌。要用无菌包装的器皿或事先消毒好的带少许培养液（内含400单位/mL抗菌素）的小瓶等便于携带的物品来取材，所取材料应避免接触有毒有害的化学物质，如碘、汞等。所取标本材料应在无菌条件下进行，为了确保无菌，对所取材料若疑有污染的可能，应将所取组织在含高浓度抗菌素（400单位/mL）甚至加入适量的两性霉素B或10%达克宁液的培养液内于4℃下存放2小时以上，再用PBS洗2~3次，以确保所取材料无菌。要用无菌包装的器皿或事先消毒好的带少许培养液（内含400单位/mL抗菌素）的小瓶等便于携带的物品来取材，所取材料应避免接触有毒有害的化学物质，如碘、汞等。所取标本材料应在无菌条件下进行，为了确保无菌，对所取材料若疑有污染的可能，应将所取组织在含高浓度抗菌素（所取标本材料应在无菌条件下进行，为了确保无菌，对所取材料若疑有污染的可能，应将所取组织在含高浓度抗菌素（400400单位单位/mL/mL）甚至加入适量的两性霉素）甚至加入适量的两性霉素BB或或10%10%达克宁液的培养液内于达克宁液的培养液内于44℃下存放℃下存放22小时以上，再用小时以上，再用PBSPBS洗洗2~32~3次，以确保所取材料无菌。要用无菌包装的器皿或事先消毒好的带少许培养液（内含次，以确保所取材料无菌。要用无菌包装的器皿或事先消毒好的带少许培养液（内含400400单位单位/mL/mL抗菌素）的小瓶等便于携带的物品来取材，所取材料应避免接触有毒有害的化学物质，如碘、汞等。抗菌素）的小瓶等便于携带的物品来取材，所取材料应避免接触有毒有害的化学物质，如碘、汞等。

（3）取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。（3）取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。（3）取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。（3）取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。（（33）取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。）取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。

（4）要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。（4）要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。（4）要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。（4）要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。（（44）要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。）要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。

（5）取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。（5）取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。（5）取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。（5）取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。（（55）取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。）取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。

（6）原代细胞取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。对组织的来源、部位、包括供体的一般情况要做详细的记录，以备以后查询。（6）原代细胞取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。对组织的来源、部位、包括供体的一般情况要做详细的记录，以备以后查询。（6）原代细胞取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。对组织的来源、部位、包括供体的一般情况要做详细的记录，以备以后查询。（6）原代细胞取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。对组织的来源、部位、包括供体的一般情况要做详细的记录，以备以后查询。（（66）原代细胞取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。对组织的来源、部位、包括供体的一般情况要做详细的记录，以备以后查询。）原代细胞取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。对组织的来源、部位、包括供体的一般情况要做详细的记录，以备以后查询。

二、原代细胞的分离和制作二、原代细胞的分离和制作二、原代细胞的分离和制作二、原代细胞的分离和制作二、原代细胞的分离和制作二、原代细胞的分离和制作

人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，即使采用1mm3的组织块，也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长，若需获取大量细胞，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来，常采用的方法如下：人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，即使采用1mm3的组织块，也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长，若需获取大量细胞，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来，常采用的方法如下：人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，即使采用1mm3的组织块，也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长，若需获取大量细胞，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来，常采用的方法如下：人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，即使采用1mm3的组织块，也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长，若需获取大量细胞，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来，常采用的方法如下：人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，即使采用人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，即使采用1mm31mm3的组织块，也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长，若需获取大量细胞，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来，常采用的方法如下：的组织块，也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长，若需获取大量细胞，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来，常采用的方法如下：

1、悬浮细胞的分离方法1、悬浮细胞的分离方法1、悬浮细胞的分离方法1、悬浮细胞的分离方法11、悬浮细胞的分离方法、悬浮细胞的分离方法

组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞 .组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞 .组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞 .组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞 .组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min1000r/min的低速离心的低速离心1010分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBSPBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞 洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞 ..

2、实体组织材料的分离方法2、实体组织材料的分离方法2、实体组织材料的分离方法2、实体组织材料的分离方法22、实体组织材料的分离方法、实体组织材料的分离方法

（1）机械分散法（1）机械分散法（1）机械分散法（1）机械分散法（（11）机械分散法）机械分散法

所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤（常用注射器钝端）使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤（常用注射器钝端）使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤（常用注射器钝端）使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤（常用注射器钝端）使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤（常用注射器钝端）使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤（常用注射器钝端）使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适

用于处理纤维成分少的软组织。用于处理纤维成分少的软组织。用于处理纤维成分少的软组织。用于处理纤维成分少的软组织。用于处理纤维成分少的软组织。用于处理纤维成分少的软组织。

（2）消化分离法（2）消化分离法（2）消化分离法（2）消化分离法（（22）消化分离法）消化分离法

a、酶消化分离法a、酶消化分离法a、酶消化分离法a、酶消化分离法aa、酶消化分离法、酶消化分离法

酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下：酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下：酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下：酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下：酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下：酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下：

（a）胰蛋白酶分散技术（a）胰蛋白酶分散技术（a）胰蛋白酶分散技术（a）胰蛋白酶分散技术（（aa）胰蛋白酶分散技术）胰蛋白酶分散技术

胰蛋白酶（简称胰酶）是广泛应用的消化剂。胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开。胰蛋白酶对细胞的作用，取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等。胰蛋白酶（简称胰酶）是广泛应用的消化剂。胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开。胰蛋白酶对细胞的作用，取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等。胰蛋白酶（简称胰酶）是广泛应用的消化剂。胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开。胰蛋白酶对细胞的作用，取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等。胰蛋白酶（简称胰酶）是广泛应用的消化剂。胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开。胰蛋白酶对细胞的作用，取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等。胰蛋白酶（简称胰酶）是广泛应用的消化剂。胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开。胰蛋白酶对细胞的作用，取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、胰蛋白酶（简称胰酶）是广泛应用的消化剂。胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开。胰蛋白酶对细胞的作用，取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pHpH以及消化时间的长短等。以及消化时间的长短等。

①细胞类型 胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织，能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。而对含结缔组织较丰富的组织，如 乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等就无效。①细胞类型 胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织，能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。而对含结缔组织较丰富的组织，如 乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等就无效。①细胞类型 胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织，能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。而对含结缔组织较丰富的组织，如 乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等就无效。①细胞类型 胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织，能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。而对含结缔组织较丰富的组织，如 乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等就无效。①细胞类型 胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织，能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。而对含结缔组织较丰富的组织，如 乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等就无效。①细胞类型 胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织，能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。而对含结缔组织较丰富的组织，如 乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等就无效。

②酶的浓度 胰蛋白酶一般采用的浓度为0.1%-0.25%（活力1:200或1:250）。②酶的浓度 胰蛋白酶一般采用的浓度为0.1%-0.25%（活力1:200或1:250）。②酶的浓度 胰蛋白酶一般采用的浓度为0.1%-0.25%（活力1:200或1:250）。②酶的浓度 胰蛋白酶一般采用的浓度为0.1%-0.25%（活力1:200或1:250）。②酶的浓度 胰蛋白酶一般采用的浓度为②酶的浓度 胰蛋白酶一般采用的浓度为0.1%-0.25%0.1%-0.25%（活力（活力1:2001:200或或1:2501:250）。）。

分离方法如下：分离方法如下：分离方法如下：分离方法如下：分离方法如下：分离方法如下：

①过夜冷消化 将取得的组织用Hanks液洗三次，剪成碎块大小为4毫米左右，用Hanks液洗2~3次以除去血球和脂肪组织，再加入0.25%的胰蛋白酶，摇匀后放4℃过夜，次日再用Hanks液洗涤，弃去上清，共洗2~3次，然后，加入少量营养液吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。①过夜冷消化 将取得的组织用Hanks液洗三次，剪成碎块大小为4毫米左右，用Hanks液洗2~3次以除去血球和脂肪组织，再加入0.25%的胰蛋白酶，摇匀后放4℃过夜，次日再用Hanks液洗涤，弃去上清，共洗2~3次，然后，加入少量营养液吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。①过夜冷消化 将取得的组织用Hanks液洗三次，剪成碎块大小为4毫米左右，用Hanks液洗2~3次以除去血球和脂肪组织，再加入0.25%的胰蛋白酶，摇匀后放4℃过夜，次日再用Hanks液洗涤，弃去上清，共洗2~3次，然后，加入少量营养液吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。①过夜冷消化 将取得的组织用Hanks液洗三次，剪成碎块大小为4毫米左右，用Hanks液洗2~3次以除去血球和脂肪组织，再加入0.25%的胰蛋白酶，摇匀后放4℃过夜，次日再用Hanks液洗涤，弃去上清，共洗2~3次，然后，加入少量营养液吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。①过夜冷消化 将取得的组织用①过夜冷消化 将取得的组织用HanksHanks液洗三次，剪成碎块大小为液洗三次，剪成碎块大小为44毫米左右，用毫米左右，用HanksHanks液洗液洗2~32~3次以除去血球和脂肪组织，再加入次以除去血球和脂肪组织，再加入0.25%0.25%的胰蛋白酶，摇匀后放的胰蛋白酶，摇匀后放44℃过夜，次日再用℃过夜，次日再用HanksHanks液洗涤，弃去上清，共洗液洗涤，弃去上清，共洗2~32~3次，然后，加入少量营养液吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。次，然后，加入少量营养液吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。

（b）胶原酶（Collagenase）消化法（b）胶原酶（Collagenase）消化法（b）胶原酶（Collagenase）消化法（b）胶原酶（Collagenase）消化法（（bb）胶原酶（）胶原酶（CollagenaseCollagenase）消化法）消化法

适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用。可用PBS和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率，最终浓度200u/mL或0.1~0.3mg/mL.适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用。可用PBS和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率，最终浓度200u/mL或0.1~0.3mg/mL.适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用。可用PBS和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率，最终浓度200u/mL或0.1~0.3mg/mL.适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用。可用PBS和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率，最终浓度200u/mL或0.1~0.3mg/mL.适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用。可用适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用。可用PBSPBS和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率，最终浓度和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率，最终浓度200u/mL200u/mL或或0.1~0.3mg/mL.0.1~0.3mg/mL.

b、非酶消化法（EDTA消化法）b、非酶消化法（EDTA消化法）b、非酶消化法（EDTA消化法）b、非酶消化法（EDTA消化法）bb、非酶消化法（、非酶消化法（EDTAEDTA消化法）消化法）

常用不含钙、镁离子的PBS配成0.02%的工作液，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好。常用不含钙、镁离子的PBS配成0.02%的工作液，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好。常用不含钙、镁离子的PBS配成0.02%的工作液，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好。常用不含钙、镁离子的PBS配成0.02%的工作液，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好。常用不含钙、镁离子的常用不含钙、镁离子的PBSPBS配成配成0.02%0.02%的工作液，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好。的工作液，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好。

消化分离法的操作步骤：消化分离法的操作步骤：消化分离法的操作步骤：消化分离法的操作步骤：消化分离法的操作步骤：消化分离法的操作步骤：

（a）剪切 把组织块剪碎，呈1~5mm3大小的组织块。（a）剪切 把组织块剪碎，呈1~5mm3大小的组织块。（a）剪切 把组织块剪碎，呈1~5mm3大小的组织块。（a）剪切 把组织块剪碎，呈1~5mm3大小的组织块。（（aa）剪切 把组织块剪碎，呈）剪切 把组织块剪碎，呈1~5mm31~5mm3大小的组织块。大小的组织块。

（b）加液漂洗 将碎组织块在平皿（或三角烧瓶）中用无钙镁PBS洗2-3次（采用倾斜，自然沉降法）。（b）加液漂洗 将碎组织块在平皿（或三角烧瓶）中用无钙镁PBS洗2-3次（采用倾斜，自然沉降法）。（b）加液漂洗 将碎组织块在平皿（或三角烧瓶）中用无钙镁PBS洗2-3次（采用倾斜，自然沉降法）。（b）加液漂洗 将碎组织块在平皿（或三角烧瓶）中用无钙镁PBS洗2-3次（采用倾斜，自然沉降法）。（（bb）加液漂洗 将碎组织块在平皿（或三角烧瓶）中用无钙镁）加液漂洗 将碎组织块在平皿（或三角烧瓶）中用无钙镁PBSPBS洗洗2-32-3次（采用倾斜，自然沉降法）。次（采用倾斜，自然沉降法）。

（c）消化 加入消化液（胰蛋白酶或胶原酶或EDTA）于37℃水浴中作用适当时间（中间可轻摇1~2次），若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。胰蛋白酶消化时间不宜过长。（c）消化 加入消化液（胰蛋白酶或胶原酶或EDTA）于37℃水浴中作用适当时间（中间可轻摇1~2次），若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。胰蛋白酶消化时间不宜过长。（c）消化 加入消化液（胰蛋白酶或胶原酶或EDTA）于37℃水浴中作用适当时间（中间可轻摇1~2次），若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。胰蛋白酶消化时间不宜过长。（c）消化 加入消化液（胰蛋白酶或胶原酶或EDTA）于37℃水浴中作用适当时间（中间可轻摇1~2次），若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。胰蛋白酶消化时间不宜过长。（（cc）消化 加入消化液（胰蛋白酶或胶原酶或）消化 加入消化液（胰蛋白酶或胶原酶或EDTAEDTA）于）于3737℃水浴中作用适当时间（中间可轻摇℃水浴中作用适当时间（中间可轻摇1~21~2次），若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。胰蛋白酶消化时间不宜过长。次），若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。胰蛋白酶消化时间不宜过长。

（d）弃去消化液 采用倾斜自然沉降或低速离心法尽量弃去消化液。（d）弃去消化液 采用倾斜自然沉降或低速离心法尽量弃去消化液。（d）弃去消化液 采用倾斜自然沉降或低速离心法尽量弃去消化液。（d）弃去消化液 采用倾斜自然沉降或低速离心法尽量弃去消化液。（（dd）弃去消化液 采用倾斜自然沉降或低速离心法尽量弃去消化液。）弃去消化液 采用倾斜自然沉降或低速离心法尽量弃去消化液。

（e）漂洗 将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入，中止消化反应，采用漂洗法洗2-3次后，加入完全培养基。（e）漂洗 将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入，中止消化反应，采用漂洗法洗2-3次后，加入完全培养基。（e）漂洗 将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入，中止消化反应，采用漂洗法洗2-3次后，加入完全培养基。（e）漂洗 将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入，中止消化反应，采用漂洗法洗2-3次后，加入完全培养基。（（ee）漂洗 将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入，中止消化反应，采用漂洗法洗）漂洗 将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入，中止消化反应，采用漂洗法洗2-32-3次后，加入完全培养基。次后，加入完全培养基。

（f）机械分散 采用吸管吹打或振荡法，使细胞充分散开后用纱网或3~4层无菌纱布过滤后分瓶培养，若要求不高可采用倾斜自然沉降5~10分钟，吸上层细胞悬液进行分瓶培养。
试验操作步骤：（f）机械分散 采用吸管吹打或振荡法，使细胞充分散开后用纱网或3~4层无菌纱布过滤后分瓶培养，若要求不高可采用倾斜自然沉降5~10分钟，吸上层细胞悬液进行分瓶培养。
试验操作步骤：（f）机械分散 采用吸管吹打或振荡法，使细胞充分散开后用纱网或3~4层无菌纱布过滤后分瓶培养，若要求不高可采用倾斜自然沉降5~10分钟，吸上层细胞悬液进行分瓶培养。
试验操作步骤：（f）机械分散 采用吸管吹打或振荡法，使细胞充分散开后用纱网或3~4层无菌纱布过滤后分瓶培养，若要求不高可采用倾斜自然沉降5~10分钟，吸上层细胞悬液进行分瓶培养。
试验操作步骤：（（ff）机械分散 采用吸管吹打或振荡法，使细胞充分散开后用纱网或）机械分散 采用吸管吹打或振荡法，使细胞充分散开后用纱网或3~43~4层无菌纱布过滤后分瓶培养，若要求不高可采用倾斜自然沉降层无菌纱布过滤后分瓶培养，若要求不高可采用倾斜自然沉降5~105~10分钟，吸上层细胞悬液进行分瓶培养。
试验操作步骤：分钟，吸上层细胞悬液进行分瓶培养。
试验操作步骤：
1)胚胎的分离。适用哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠)1)胚胎的分离。适用哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠)1)胚胎的分离。适用哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠)1)胚胎的分离。适用哺乳动物(仓鼠、小鼠和大鼠)1)1)胚胎的分离。适用哺乳动物胚胎的分离。适用哺乳动物((仓鼠、小鼠和大鼠仓鼠、小鼠和大鼠))
a．采用认可的方案处死啮齿动物。a．采用认可的方案处死啮齿动物。a．采用认可的方案处死啮齿动物。a．采用认可的方案处死啮齿动物。aa．采用认可的方案处死啮齿动物。．采用认可的方案处死啮齿动物。
b．立即在无菌超净台内用70％乙醇擦洗整个动物。b．立即在无菌超净台内用70％乙醇擦洗整个动物。b．立即在无菌超净台内用70％乙醇擦洗整个动物。b．立即在无菌超净台内用70％乙醇擦洗整个动物。bb．立即在无菌超净台内用．立即在无菌超净台内用7070％乙醇擦洗整个动物。％乙醇擦洗整个动物。
c．用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。c．用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。c．用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。c．用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。cc．用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。．用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。
d．用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。d．用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。d．用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。d．用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。dd．用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。．用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。
e．剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌PBS的100ml烧杯中。e．剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌PBS的100ml烧杯中。e．剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌PBS的100ml烧杯中。e．剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌PBS的100ml烧杯中。ee．剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌．剔除胚胎周围的包膜，将胚胎放于无菌的含有无菌PBSPBS的的100ml100ml烧杯中。烧杯中。
f．漂洗胚胎，去掉PBS。继续用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。f．漂洗胚胎，去掉PBS。继续用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。f．漂洗胚胎，去掉PBS。继续用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。f．漂洗胚胎，去掉PBS。继续用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。ff．漂洗胚胎，去掉．漂洗胚胎，去掉PBSPBS。继续用。继续用PBSPBS漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。

2)将1－2个胚胎转移至一个小的无菌培养皿中，用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎， 用PBS漂洗。2)将1－2个胚胎转移至一个小的无菌培养皿中，用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎， 用PBS漂洗。2)将1－2个胚胎转移至一个小的无菌培养皿中，用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎， 用PBS漂洗。2)将1－2个胚胎转移至一个小的无菌培养皿中，用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎， 用PBS漂洗。2)2)将将11－－22个胚胎转移至一个小的无菌培养皿中，用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎， 用个胚胎转移至一个小的无菌培养皿中，用新的无菌剪刀小心地绞碎胚胎， 用PBSPBS漂洗。漂洗。
3)在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一50ml 的无菌离心筒中, 加入40ml 0.25％的无菌胰蛋白酶,用搅拌棒轻轻搅动 。3)在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一50ml 的无菌离心筒中, 加入40ml 0.25％的无菌胰蛋白酶,用搅拌棒轻轻搅动 。3)在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一50ml 的无菌离心筒中, 加入40ml 0.25％的无菌胰蛋白酶,用搅拌棒轻轻搅动 。3)在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一50ml 的无菌离心筒中, 加入40ml 0.25％的无菌胰蛋白酶,用搅拌棒轻轻搅动 。3)3)在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一在无菌状态下，将绞碎的胚胎转移于一50ml 50ml 的无菌离心筒中的无菌离心筒中, , 加入加入40ml 0.2540ml 0.25％的无菌胰蛋白酶％的无菌胰蛋白酶,,用搅拌棒轻轻搅动 。用搅拌棒轻轻搅动 。
4)在温暖的环境中或置于37 °C培养箱中轻轻摇动15分钟。4)在温暖的环境中或置于37 °C培养箱中轻轻摇动15分钟。4)在温暖的环境中或置于37 °C培养箱中轻轻摇动15分钟。4)在温暖的环境中或置于37 °C培养箱中轻轻摇动15分钟。4)4)在温暖的环境中或置于在温暖的环境中或置于37 37 °°CC培养箱中轻轻摇动培养箱中轻轻摇动1515分钟。分钟。
5)让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中，该管内按照每10ml上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活,胰蛋白酶。5)让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中，该管内按照每10ml上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活,胰蛋白酶。5)让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中，该管内按照每10ml上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活,胰蛋白酶。5)让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中，该管内按照每10ml上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活,胰蛋白酶。5)5)让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml50ml的离心管中，该管内按照每的离心管中，该管内按照每10ml10ml上清加入上清加入l mll ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活小牛血清的比例加入牛血清以灭活,,胰蛋白酶。胰蛋白酶。

6)加人新鲜胰蛋白酶溶液(见前述步骤)于含有残留未消化组织块的原来的50ml离心筒中，重复步骤4和5。6)加人新鲜胰蛋白酶溶液(见前述步骤)于含有残留未消化组织块的原来的50ml离心筒中，重复步骤4和5。6)加人新鲜胰蛋白酶溶液(见前述步骤)于含有残留未消化组织块的原来的50ml离心筒中，重复步骤4和5。6)加人新鲜胰蛋白酶溶液(见前述步骤)于含有残留未消化组织块的原来的50ml离心筒中，重复步骤4和5。6)6)加人新鲜胰蛋白酶溶液加人新鲜胰蛋白酶溶液((见前述步骤见前述步骤))于含有残留未消化组织块的原来的于含有残留未消化组织块的原来的50ml50ml离心筒中，重复步骤离心筒中，重复步骤44和和55。。
7)离心混合的细胞悬液，1200r/rain，5分钟，弃上清。7)离心混合的细胞悬液，1200r/rain，5分钟，弃上清。7)离心混合的细胞悬液，1200r/rain，5分钟，弃上清。7)离心混合的细胞悬液，1200r/rain，5分钟，弃上清。7)7)离心混合的细胞悬液，离心混合的细胞悬液，1200r/rain1200r/rain，，55分钟，弃上清。分钟，弃上清。
8)用新鲜的无菌PBS重悬沉淀的细胞，按步骤7再次离心。8)用新鲜的无菌PBS重悬沉淀的细胞，按步骤7再次离心。8)用新鲜的无菌PBS重悬沉淀的细胞，按步骤7再次离心。8)用新鲜的无菌PBS重悬沉淀的细胞，按步骤7再次离心。8)8)用新鲜的无菌用新鲜的无菌PBSPBS重悬沉淀的细胞，按步骤重悬沉淀的细胞，按步骤77再次离心。再次离心。
9)用PBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止。9)用PBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止。9)用PBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止。9)用PBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止。9)9)用用PBSPBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止。反复洗涤细胞直至上清清亮为止。