特别提示：包括lncRNA cDNA第一链合成试剂盒（去除基因组DNA)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！

特别提示：包括lncRNA cDNA第一链合成试剂盒（去除基因组DNA)在内，本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！
产品名称：lncRNA cDNA第一链合成试剂盒（去除基因组DNA)
英文名称：lncRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit （With gDNase)
产品货号：WH0126
产品规格：20μl×25次|20μl×100次

本试剂盒是专门针对长链非编码RNA （lncRNA)反转录而开发的产品。与mRNA相比，lncRNA具有丰度低、GC含量差异大、二级结构更复杂等特性，传统反转录试剂对lncRNA难以达到理想的效果。本试剂盒含有高效去除基因组DNA的gDNase，通过42℃，3min即可去除RNA样品中残留的基因组DNA，可有效避免残留的基因组DNA对后续PCR检测结果的干扰。本试剂盒中lnR RT Enzyme Mix中使用的反转录酶为QuickKing RT Enzyme，此酶是通过分子改造后的新型反转录酶，特别增加了疏水motif，具有更强的RNA亲和性和热稳定性，从而进一步提高了其反转录效率和反应速率，42℃、15 min即可完成cDNA第一链的合成，且反转录长度至少可达10 kb。另外，新型酶与RNA亲和力的更强，配合特殊优化过的缓冲体系和引物体系，使本试剂盒在通读GC含量高，二级结构复杂，低丰度的RNA模板和抗逆性等方面表现突出，特别适合表达水平相对较低，二级结果相对复杂的lncRNA的反转录反应。

产品特点：产品特点：
·性能卓越：反转录效率可达95%以上，Total RNA最低检测下限可达10ng，反转录长度可达10 kb以上。
·简单快速：反应体系配制简单，21 min完成lncRNA cDNA第一链的合成；
·适用广泛：能够通用于GC含量差异大，二级结构复杂，低丰度的RNA模板；对不同物种来源及杂质较多的RNA模板的适用性高；
·兼容性好：后续配合荧光定量检测产品，灵敏度高、稳定性好。

试剂盒组成：试剂盒组成：

组分	25次	100次
5×gDNA Buffer	50μl	200 μl
lnR-RT Primer Mix	50μl	200 μl
lnR RT Enzyme Mix	25 μl	100 μl
10×lnR RT Buffer	50μl	200 μl
RNase-Free ddH2O	1ml	2×1ml

组分25次100次5×gDNA Buffer50μl200 μllnR-RT Primer Mix50μl200 μllnR RT Enzyme Mix25 μl100 μl10×lnR RT Buffer50μl200 μlRNase-Free ddH2O1ml2×1ml组分25次100次组分组分25次25次100次100次5×gDNA Buffer50μl200 μl5×gDNA Buffer5×gDNA Buffer50μl50μl200 μl200 μllnR-RT Primer Mix50μl200 μllnR-RT Primer MixlnR-RT Primer Mix50μl50μl200 μl200 μllnR RT Enzyme Mix25 μl100 μllnR RT Enzyme MixlnR RT Enzyme Mix25 μl25 μl100 μl100 μl10×lnR RT Buffer50μl200 μl10×lnR RT Buffer10×lnR RT Buffer50μl50μl200 μl200 μlRNase-Free ddH2O1ml2×1mlRNase-Free ddH2ORNase-Free ddH2O1ml1ml2×1ml2×1ml
储存条件：-20℃可保存一年。

注意事项：注意事项：（请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。）
1．下列操作步骤适用于模板量为10ng-2μg的Total RNA，如果Total RNA量大于2μg，请按比例扩大反应体系。
2．在冰上进行操作，防止RNA发生降解。
3．对于二级结构很复杂的RNA模板，推荐使用变性步骤，即在操作步骤之前，将模板RNA在65℃孵育5 min后迅速转移到冰上，然后再进行下一步操作。
4．根据实验需求不同，也可以选用Oligo-dT Primer或Gene Specific Primer，引物使用量：
Oligo-dT Primer 50pmol/20 μl反应体系，
Gene Specific Primer 5pmol/20 μl反应体系。
5．当PCR反应有非特异性扩增时，将反转录温度升到50℃会有改善。

对RNA模板的要求：对RNA模板的要求：
反转录酶以RNA为模板合成第一链cDNA，模板RNA的质量和数量直接影响反转录的结果。

1．模板的完整性：模板RNA的完整性对反转录非常重要，若RNA模板中含有RNase酶将降解模板RNA，最后导致cDNA产物的量少甚至无cDNA产物。
2．模板的纯度：若RNA模板中含有蛋白、盐离子、EDTA、乙醇、酚等杂质，将影响反转录酶的活性，最后影响反转录结果。
3．模板的加量：上述操作步骤适用于模板RNA量为10ng-2μg，如果模板RNA的量大于2μg，请按比例扩大反应体系。

操作步骤：操作步骤：
10ng-2μg Total RNA可建立20 μl反应体系，具体过程如下所示：

1．将模板RNA在冰上解冻；5×gDNA Buffer、lnR-RT Primer Mix、10×lnR RT Buffer、RNase-Free ddH2O在室温（15-25℃）解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。
注意：以下操作步骤请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先配制成Mix，然后再分装到每个反应管中。
2．按照表1的基因组DNA的去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心，并置于42℃，孵育3min。然后置于冰上放置。
表1：gDNA去除反应体系表1：gDNA去除反应体系

组分	用量	终浓度
Total RNA	10ng-2μg
5×gDNA Buffer	2 μl	1×
RNase-Free ddH2O	补至10μl

组分用量终浓度Total RNA10ng-2μg5×gDNA Buffer2 μl1×RNase-Free ddH2O补至10μl组分用量终浓度组分组分用量用量终浓度终浓度Total RNA10ng-2μgTotal RNATotal RNA10ng-2μg10ng-2μg5×gDNA Buffer2 μl1×5×gDNA Buffer5×gDNA Buffer2 μl2 μl1×1×RNase-Free ddH2O补至10μlRNase-Free ddH2ORNase-Free ddH2O补至10μl补至10μl
3．按照表2的反转录反应体系配制混合液。
表2：反转录反应体系表2：反转录反应体系

组分	用量	终浓度
10×lnR RT Buffer	2 μl	2×
lnR RT Enzyme Mix	1 μl	-
lnR-RT Primer Mix	2 μl	-
RNase-Free ddH2O	补足到10 μl	-

组分用量终浓度10×lnR RT Buffer2 μl2×lnR RT Enzyme Mix1 μl-lnR-RT Primer Mix2 μl-RNase-Free ddH2O补足到10 μl-组分用量终浓度组分组分用量用量终浓度终浓度10×lnR RT Buffer2 μl2×10×lnR RT Buffer10×lnR RT Buffer2 μl2 μl2×2×lnR RT Enzyme Mix1 μl-lnR RT Enzyme MixlnR RT Enzyme Mix1 μl1 μl--lnR-RT Primer Mix2 μl-lnR-RT Primer MixlnR-RT Primer Mix2 μl2 μl--RNase-Free ddH2O补足到10 μl-RNase-Free ddH2ORNase-Free ddH2O补足到10 μl补足到10 μl--
4．将反转录反应中的Mix加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀后即完成20 μl反应体系。
5．42℃，孵育15 min。
6．95℃，孵育3min之后放于冰上，得到的cDNA可用于后续实验，或低温保存。

注意：
1．若后续实验为实时荧光定量PCR，反转录产物的加量应不超过PCR体系终体积的1/10，例如50μl的PCR反应体系，反转录产物的加量应不超过5 μl。
2．反转录结束后，请将反转录产物置于冰上，再进行后续PCR反应配制；如果需要长时间保存，请置于-20℃。

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