1. 试剂配制： a) Buffer P1 (重悬液) 配制。将 RNase A 全部加入 Buffer P1 中，混匀，4 ℃保存。 b) Buffer W3（漂洗液）配制。溶液中加入 70 mL 无水乙醇，混匀。
2. 细菌收集。将菌液加入 50 mL 离心管，12,000×g 离心 2 min，弃上清。剩余菌液加入对应的离心 管中，再次离心并弃上清，直至所有菌液收集完毕，将离心管倒立在纸巾上，吸尽残余液体。
3. 加入 7.5 mL Buffer P1（请检查是否加入 RNase A），振荡（Vortex）至细菌完全重悬。 （若细菌沉淀没有完全重悬，会影响裂解效果，降低质粒 DNA 提取量。）
4. 加入 7.5 mL Buffer P2（室温较低时，Buffer P2 易沉淀，请在 37 ℃水浴锅中加热 10 min，待沉 淀消失后再使用），轻柔地上下翻转 20 次，液体变透明，保证细菌充分裂解。 （不要剧烈震荡（Vortex），以免 DNA 断裂。裂解时间不宜超过 5 min，以免质粒 DNA 受到 破坏。细菌充分裂解后液体变得清亮粘稠。如果仍然浑浊，则细菌过量，裂解不彻底，应加大 裂解液用量。）
5. 加入 10.5 mL Buffer P3，立即温和地上下翻转 20 次，充分混匀，出现白色絮状沉淀。 （混匀要充分，以免出现局部沉淀，影响中和效果。）
6. 12,000×g 离心 10-20 分钟，上清液利用裂解液过滤器过滤，滤液转入 50 mL 离心管中。
7. 加入 2 mL 磁珠（吸取磁珠前，请震荡充分混匀），混合器中室温旋转孵育 30 min。
8. 将离心管置于磁力架上，使磁珠凝集，或 8000 ×g 离心 2 min，沉淀磁珠，弃上清。
9. 加入 5 mL Buffer W1（去蛋白液），轻轻震荡 10 sec，磁力法或离心法沉淀磁珠，弃上清。
10. 加入 5 mL Buffer W3（漂洗液，请先检查是否加入无水乙醇），轻轻震荡 10 sec，磁力法或离心 法沉淀磁珠，弃液体。
11. 8,000×g 离心 2 min，尽量吸取残余液体，保留磁珠沉淀。
12. 加入 2 mL Elution Buffer D 或 ddH2O（70 ℃预热，增加洗脱效果），剧烈震荡（Vortex）1 min， 磁力法或离心法沉淀磁珠，上清即为质粒 DNA 溶液，转入新的离心管。
13. 再次加入 2 mL 新的 70 ℃预热的 Elution Buffer D 或 ddH2O，剧烈震荡（Vortex）1 min，8,000×g 离心 2 min，转移上清，并与上次的质粒 DNA 溶液混合。
14. 用试剂盒提供的质粒溶液过滤器（针头滤器）过滤质粒溶液，除去杂质，提高质粒 DNA 纯度。
15. 测定质粒 DNA 浓度，或置于-20 ℃冰箱中保存。