| 提供商 | 云南临康生物 |
| 实验步骤 | 1、在冰浴的无核酸酶的离心管中加入如下反应混合物： 1-5 µg 总 RNA 或 50-500 ng mRNA； 2 µl oligo (dT)15 或 2 µl Random 或 2 pmole 基因特异引物； 2 µl 超纯 dNTP(2.5 mM each)； 补 RNase-free ddH2O 定容至 14.5 µl。 2、70℃加热 5 分钟后迅速在冰上冷却 2 分钟。简短离心收集反应液后加入以下 各组分： 4 µl 5×First-Strand Buffer（含有 DTT）； 0.5 µl RNasin。 3、加 1 µl（ 200 U） TIANScript M-MLV，轻轻用移液器混匀。如果用随机引物， 请将离心管置 25℃温浴 10 分钟。 4、42℃温浴 50 分钟。 5、95°C 加热 5 分钟终止反应，置冰上进行后续实验或冷冻保存。 如果需要用 RNase H 处理，进行步骤 6。否则，进行步骤 7。 6、加 RNase H 1 µl (2 U)， 37°C 温浴 20 分钟以降解 RNA。然后 95°C 加热 5 分钟使酶失活。 7、用 RNase-free ddH2O 将反应体系稀释到 50 µl，取 2-5 µl 进行 PCR 扩增反 应。 |
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