摘要：动物模型是现代生命科学研究的重要工具，特别是基因工程小鼠和大鼠，在基因功能研究、人类生理病理机制研究及新药研发中起着不可替代的作用。近几年来，制备动物模型的基因修饰技术层出不穷，这不仅包括传统ES打靶、TALEN、CRISPR/Cas9，还有TetraOneTM 基因敲除新技术。我们将对这四种技术的原理、特点、缺陷、未来发展趋势作系统的介绍和对比，供您的科研选择参考。
1、传统ES打靶基因敲除：技术成熟、修饰准确、效果稳定，但制作周期长达一年
基于胚胎干细胞的同源重组技术俗称“传统的基因打靶技术”。因具有技术成熟、修饰准确、效果稳定等优点而受到众多科学家一致好评，此外，世界上所有重要的的小鼠动物模型均通过此技术制备。尽管新兴核酸酶敲除技术如ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等相继出现，但基于胚胎干细胞的同源重组技术依然是唯一可以满足所有基因组修饰要求的技术。
基因打靶就是通过同源重组技术将外源基因定点整合进靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的。基因打靶技术目前已被广泛认为是一种理想的特定修饰与改造生物体遗传物质的最佳方法，其中包括了多种不同的基因敲除和敲入系统，特别是条件性和诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因在时间和空间上的靶位修饰更加明确、效果更加精确可靠。
2、TALEN基因敲除：周期短，但存在马赛克现象和脱靶现象
TALEN 技术是一种新的分子生物学工具。科学家发现，来自一种植物细菌的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的，它克服了ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，且具有ZFN相等或更好的灵活性，使基因操作变得更加简单方便。但因为脱靶的问题，利用TALEN技术进行小鼠的基因修饰仍然无法取代传统技术。加上存在马赛克现象，所以在做基因敲入（KI）和其他应用时候也必须谨慎的进行检测。
3、CRISPR/Cas9基因敲除：周期短，但存在马赛克现象和脱靶现象
CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是最新出现的一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。 CRISPR 是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。在这一系统中，crRNA（CRISPR-derived RNA）通过碱基配对与tracrRNA（trans-activating RNA）结合形成双链RNA，此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶定位点剪切双链DNA达到对基因组DNA进行修饰的目的。CRISPR/Cas9系统能够对小鼠和大鼠基因组特定基因位点进行精确编辑， 目前已经成功应用于大小鼠基因的KO/KI模型制备，其原理也是对目的片段产生特异的切割后，修复过程中产生移码突变或者是片段缺失，或者是在切开位置产生片段插入等现象。
4、 TetraOneTM基因敲除：技术成熟、修饰准确、效果稳定，制作周期只需6个月
TetraOneTM基因敲除是业界推出的新技术，沿用胚胎干细胞同源重组的技术体系，采用独特的建系和基因改造技术建立了具有遗传优势的TetraOneTMES细胞系，通过胚胎发育前期的显微注射，使TetraOneTMES细胞100%代替内源ES细胞，实现跨越“嵌合体”阶段从而快速获得去Neo杂合子小鼠的基因打靶专利技术。
TetraOneTM 技术是基于胚胎干细胞技术的金标准，通过同源重组技术将外源基因定点整合进靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造基因组某一基因的目的。同时TetraOneTM 技术还具有核酸酶技术周期短的优势，将传统ES打靶技术的周期缩短一半，并且不会像核酸酶技术一样带来脱靶效应和马赛克现象，在核酸酶技术没有成熟之前，TetraOneTM技术将是研究者最佳的选择。
不同的基因修饰技术对比分析：
| 技术类型 | 传统ES打靶技术 | TetraOneTM打靶技术 | TAELN | CRISPR/Cas9 |
| 技术方法 | ES细胞的同源重组 囊胚注射 | TetraOneTM ES细胞同源重组TetraOneTM注射技术 | 核酸酶技术 原核注射 | 核酸酶技术 原核注射 |
| DNA载体 | 利用同源臂进行同源重组，并利用正负筛选基因，筛选阳性克隆 | 利用同源臂进行同源重组，并利用正负筛选基因，筛选阳性克隆 | TALE vector pair/FokI-dimer nuclease TALEN识别序列和FokI酶 | gRNA vector/Cas9 nuclease gRNA识别序列和Cas9核酸酶 |
| 基因随机插入与脱靶效应 | 无 | 无 | 会有一点概率的随机插入和脱靶效应（取决于TALEN识别序列） | 会有一点概率的随机插入和脱靶效应（取决于gRNA识别序列） |
| 结果再现性 | 非常好 | 非常好 | 一般 | 一般 |
| 制作周期 | 8-12月 | 6-8月 | 5-7月 | 5-7月 |
| 技术应用的研究范围 | 完全性基因敲除，条件性基因敲除，基因定点插入，点突变研究，人源化研究 | 完全性基因敲除，条件性基因敲除，基因定点插入，点突变研究，人源化研究 | 完全性基因敲除，基因定点插入，点突变研究，人源化研究 | 完全性基因敲除，基因定点插入，点突变研究，人源化研究 |
| 物种限制 | 小鼠 | 小鼠 | 无 | 无 |
| 成果保证 | 有 | 有 | 基因敲除有保证，其他用途有不确定性 | 基因敲除有保证，其他用途有不确定性 |
| 技术流程要点 | DNA打靶载体，ES阳性克隆，细胞注射，嵌合体鼠获得，F1鼠获得，纯合鼠获得 | DNA打靶载体，ES阳性克隆，细胞注射，去Neo杂合子鼠，纯合鼠获得 | 载体构建，F1杂合子鼠（大鼠与小鼠）获得 | 载体构建，F1杂合子鼠（大鼠与小鼠）获得 |
| 筛选繁殖 | 无需特殊工作，可以直接进行后续试验 | 无需特殊工作，可以直接进行后续试验 | 需要排除马赛克现象对后续生殖遗传的影响，并排除脱靶效应的影响 | 需要排除马赛克现象对后续生殖遗传的影响，并排除脱靶效应的影响（KI需要考虑随机插入的影响） |
| 技术类型 | 技术原理 | 随机插入现象 | 脱靶现象 | 马赛克现象 |
| 传统ES打靶技术 | 大片段的同源重组 | 可以排除所有的随机插入，所有随机插入的克隆都可以被Southern Blot检测到并排除 | 无脱靶风险 因为同源重组技术是一个极度保守的技术，只有几个碱基的差异就同源重组发生的概率就会大大下降 | 无 动物由单一克隆发育而成，修饰的基因型一致 |
| TALEN技术 | KO：核酸酶定点切割 KI：核酸酶定点切割后产生DNA断口，相对提高该位点的短片段同源重组效率 | 无法排除风险 特别是在做KI的应用时候，线性化的DNA会产生较高概率的随机插入 | 无法排除风险 TALEN识别序列较短，获得的动物必须进行脱靶效应的检测 | 存在 如果核酸酶起作用不是在胚胎的单细胞阶段，就会出现一个动物有多种修饰基因型的现象 |
| CRISPR/Cas9技术 | KO :核酸酶定点切割 KI：核酸酶定点切割后产生DNA断口，相对提高该位点的短片段同源重组效率 | 无法排除风险 特别是在做KI的应用时候，线性化的DNA会产生较高概率的随机插入 | 无法排除风险 gRNA识别序列较短，获得的动物必须进行脱靶效应的检测 | 存在 如果核酸酶起作用不是在胚胎的单细胞阶段，就会出现一个动物有多种修饰基因型的现象 |
| TetraOneTM 技术 | 大片段的同源重组 | 可以排除所有的随机插入，所有随机插入的克隆都可以被Southern Blot检测到并排除 | 无脱靶风险 因为同源重组技术是一个极度保守的技术，只有几个碱基的差异就同源重组发生的概率就会大大下降 | 无 动物由单一克隆发育而成，基因型一致 |
