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病毒滴度检测试剂盒（Q-PCR）

价格：￥1980

品牌：东岭生物

最新更新日期：2021-06-04 14:07

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江苏博美达生命科学有限公司

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公司：江苏博美达生命科学有限公司

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产品属性

规格

100 test

产品说明

产品内容

试剂名称	内容	数量
Solution 1	标准品DNA模板（5x10^9 copies/μl）	100μl
Solution2	Lenti-primer (10μM)	40μl
Solution 3	Lenti-probe –FAM/TAMRA(2.5μM)	80μl
Solution 4	Taq (probe qPCR) (2X)	1ml
Solution 5	ROXI(50X)	40μl
Solution 6	ROX II(50X)	80μl

其他所需材料
细胞基因组DNA抽提试剂（离心柱法）
超纯水
Q-PCR用96孔板或8连管
定量PCR仪
1.5ml无酶离心管用于样品制备
无酶枪尖

储存条件
所有试剂储存于-20℃，应避免反复冻融，请根据实验情况分装使用。

简介
本试剂盒能够快速、简便、高效地对基于HIV-1构建的慢病毒进行有效滴度测定。通过对感染慢病毒的细胞基因组DNA中整合的慢病毒插入片段拷贝数进行Q-PCR测定，计算出初始病毒的有效滴度。
优势：
1.因本品所用模板为感染病毒后靶细胞基因组，与以病毒RNA为模板进行的滴度测定相比，所得滴度为病毒的真实感染滴度，即活性滴度，对后续实验有更准确的指导意义；
2.本品检测试剂基于Taqman探针法开发，结果更准确；
3.检测位点位于HIV-1病毒基因组保守区，适用于所有基于HIV-1病毒构建的慢病毒滴度测定。

操作流程

操作步骤
注：请在实验开始前认真阅读完整实验步骤
本说明概述了从感染慢病毒的293T细胞基因组中测定所用病毒滴度的方法，Q-PCR直接所得数据为所取细胞中慢病毒的拷贝数，用户可根据计算公式，对最终滴度进行相应计算。
Q-PCR相对灵敏，请尽量确保实验环境及所用试剂耗材无其他DNA和DNase污染。

取感染72h后的293T细胞，胰酶消化制备单细胞悬液，细胞计数，得细胞数为N;
利用细胞基因组抽提试剂盒提取293T细胞基因组DNA，测定基因组DNA总量为G (μg)，稀释至50ng/μl备用；

注：此步骤推荐使用分离柱式基因组抽提试剂盒

根据下表稀释标准品及基因组DNA样品：

	标准品管				样品管
#	稀释倍数	Water	标准品	拷贝数/μl	稀释倍数	Water	样品(50ng/μl)
1	10^1	45μl	5μl	5.45x10^8	10	45μl	5μl
2	10^2	45μl	5μl of 1#	5.45x10^7	50	40μl	10μl of #1
3	10^3	45μl	5μl of 2#	5.45x10^6	100	45	5μl of #1
4	10^4	45μl	5μl of 3#	5.45x10^5
5	10^5	45μl	5μl of 4#	5.45x10^4
6	10^6	45μl	5μl of 5#	5.45x10^3

梯度稀释取样前，需充分混匀；

根据下表配制反应液，每组配制3个复孔：

试剂	用量	终浓度
标准品或样本	2μl	*1
Lenti-primer (10μM)	0.4μl	0.2μM
Lenti-probe (2.5μM)	0.8μl	0.1μM
Taq (probe qPCR) (2X)	10μl	1X
ROX	*2
Water	补至20μl

*1：样本除步骤3中稀释的3种浓度外，另需一组未稀释样本，即总量为100ng/孔；另需设置阴性对照孔，即不添加任何DNA模板；
*2：根据所使用仪器添加：

	适用仪器
ROX I (终浓度1X)	7300 Real-Time PCR System/ StepOnePlus Real-Time PCR System
ROX II (终浓度0.5X)	7500 Real-Time PCR System/7500 Fast Real-Time PCR System
无需ROX	Thermal Cycler Dice Real Time System series/ LightCycler 480 System/ CFX96 Real-Time PCR Detection System

上机，按照以下程序进行Q-PCR反应：

Denature (1 Cycle)
95℃ 30s
Quantification (40 cycles)
95℃ 5s
60℃ 30s
注：可根据具体使用仪器自行调整程序。

计算标准曲线：计算每组标准品的平均Ct值，以平均Ct值为X，Log_e^{(copy number)}为Y，生成标准曲线Y=A*Ct+B。标准曲线R²需大于0.99；（具体过程可见举例）
计算样本平均Ct值，带入标准曲线计算出copy number=n。

注：以Ct值在标准曲线范围内的数据为准，若样本Ct值超过或低于标准曲线Ct值，需对样本稀释倍数进行相应调整。

计算病毒滴度：举例

Titer(TU/ml)=[n*d*(G/0.1)/N]*N^ori/V
其中：n=步骤7中计算所得拷贝数；d=所用Ct值对应的稀释倍数(1, 10, 50, 100)；G=基因组提取所得DNA总量(μg)；N=基因组提取所用细胞数；N^ori=病毒感染时细胞数；V=病毒感染时病毒用量(ml)。
计算各个Ct值位于标准曲线范围内的不同稀释倍数组病毒滴度，取平均值为最终结果。（具体过程可见举例）

举例：

标准曲线Ct值：

稀释倍数	10^1	10^2	10^3	10^4	10^5	10^6	阴性对照
Copy number	5x10^8	5x10^7	5x10^6	5x10^5	5x10^4	5x10^3	0
平均Ct值	12.385	18.175	21.76	26.15	29.03	32.89	Null

计算Y=log_e(copy number)，以X=平均Ct值和Y做标准曲线，如下：

从而得到标准曲线y=-0.5722x+27.662，R²>0.99。

计算样品各稀释倍数的对应拷贝数：

稀释倍数	1	10	50	100
平均Ct值	23.786	27.316	29.993	30.656
log_e(copy number)	14.05126933	12.03140333	10.49981467	10.12025533
X=Copy number	1265868.915	167946.933	36308.77282	24841.11279
×稀释倍数	1265868.915	1679469.33	1815438.641	2484111.279

本表格最后所得数据为100ng样品中病毒基因组拷贝数。

计算病毒滴度：

本实验所用细胞的病毒感染条件为：1x10^4细胞中加入1μl慢病毒原液，即N^ori=1x10^4，V=1/1000ml；
所用DNA样本从5x10^5细胞中提取，共获得3.5μg基因组DNA，即N=5x10^5，G=3.5μg；
将以上参数带入公式中得：

稀释倍数	1	10	50	100
X=Copy number	1265868.915	167946.933	36308.77282	24841.11279
×稀释倍数	1265868.915	1679469.33	1815438.641	2484111.279
各组Titer	8.86x10^8	1.18x10^9	1.27x10^9	1.74x10^9
平均Titer	1.27x10^9

因此，本实验所用病毒滴度为：1.27x10^9 TU/ml。

常见问题

常见问题	建议
不同稀释倍数计算所得滴度差异大	Ct值不在标准曲线范围内，导致计算所得数据不准确；加样或其他因素导致的误差；建议调整稀释倍数或选取在标准曲线内的数据进行计算
空白对照组信号强	可能由DNA污染导致，实验前需彻底清洁实验区域，使用干净的枪头、离心管等耗材
标准曲线R²<0.99	多由加样误差导致，需提高加样准确性，勤换枪头，使用排枪和低吸附枪头从而减少加样误差
样品Ct值过高	确保DNA取样准确，必要时可对样品DNA加大稀释倍数
样品Ct值过低	确认样品DNA质量及浓度；若是因病毒感染效率低导致，可对病毒进行浓缩处理，或提高病毒感染用量