人铁调素酶联免疫吸附测定试剂盒
Human Hepcidin ELISA Kit
本产品冰袋运输；保存于4℃(其中 标准品 需保存于-20℃)，保质期6个月；标准品如存放于4℃，1~2周内有效。
货号规格
HJ04396次
产品特点g
d高灵敏度——多次重复结果表明，最小检出量为3.2 pg/mL；
gd高特异性——与人α2-Macroglobulin及小鼠Hepcidin均无交叉反应；
gd重复性好——板内，板间变异系数均小于10%。
产品简介
本试本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样品中人总铁调素(Hepcidin)的浓度，包括Hepcidin-20、 Hepcidin-22、Hepcidin-24和 Hepcidin-25。人铁调素捕获抗体已经预包被于酶标板上，当加入样品或标准品时，其中的人铁调素会与捕获抗体结合，而其它游离成分则会通过洗涤被除去。接着，再加入生物素化的抗人铁调素抗体后，抗人铁调素抗体与人铁调素接合，形成夹心的免疫复合物，其它游离成分则通过洗涤被除去。随后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲合素，生物素与亲合素特异性结合，这样亲合素上标记的HRP就与夹心的免疫复合物连接起来，而其它游离成分则通过洗涤被除去。最后加入显色剂，若样品中存在人铁调素，则会形成免疫复合物，其上连接的HRP会催化无色的显色剂氧化生成蓝色物质，而后加入终止液，最终产物呈黄色。通过酶标仪检测，读其450 nm处的OD值，人铁调素浓度与OD450值之间呈正比，通过检测标准品绘制标准曲线，对照未知样品中OD值，即可计算出样品中人铁调素的浓度。
背景简介
本试铁调素(HAMP)是一种属于铁调素家族的分泌蛋白，在体内主要由肝脏、心脏以及脑产生，是哺乳动物的铁循环的关键调控分子。铁调素前体蛋白经过不同方式的剪接后，可分别形成20、22和25个不同氨基酸数量的成熟多肽，这些多肽内均富含半胱氨酸，从而形成二硫键使β片层结构更稳定。
本试铁调素可以下调铁输出蛋白——膜铁转运蛋白(ferroportin，FPN)，从而抑制肠道铁吸收和储铁器官铁释放，负性调控铁稳态的平衡。除肝脏外，其它器官也可表达少量铁调素，铁调素的表达受铁储量、红细胞生成活性、炎症、缺氧、内质网应激及甾体类激素等调节。铁调素过少可引起铁过载类疾病，铁调素过多可导致铁利用障碍性贫血、炎症性贫血等疾病。
产品内容| 组分 | 体积或数量 |
| 人铁调素预包被板 | 12条 |
| 标准品稀释液(5×) | 20mL |
| 人铁调素标准品 | ≥2支(冻干) |
| 人铁调素生物素化抗体 | 10mL |
| HRP标记的亲和素 | 10mL |
| 浓缩洗涤液(20×) | 30mL |
| 显色剂TMB | 10mL |
| 终止液 | 5mL |
| 封板胶纸 | 3张 |
操作步骤good◆ 样品制备
good◆gg1. 根据样品种类选择相应的处理方法：
good◆ 样1. 根A. 细胞上清：将细胞培养上清液100~500×g离心5 min，去除悬浮物后即可；
good◆ 样1. 根B. 血清样品：将全血在室温下静置0.5~2 h，待其自然凝固并析出血清后，离心取黄色上清即可(4℃，1,000~2,000×g，10 min)，注意请勿吸取沉淀，制备好的血清需置于冰上待用，请勿在其中添加任何防腐剂或抗凝剂；
good◆ 样1. 根C. 血浆样品：使用EDTA对全血进行抗凝处理后，混合均匀置于冰上，离心取黄色上清即可(4℃，1,000~2,000×g，10 min)，注意请勿吸取沉淀，制备好的血浆需置于冰上待用；
注意：① 人血清或血浆样品需稀释后再进行检测；
注意：②若待测样品无法及时检测，样品制备完成后，请分装冻存于-20℃，避免反复冻融；
注意：③ 请保证待测样品清澈透明，检测前如发现样品中有悬浮物，需通过离心去除；
注意：④ 为了保证检测结果准确，请勿使用溶血、黄疸、高血脂或污染的样品。good◆ 检测准备工作
good◆gg2. 试剂盒自冰箱取出后，请置于室温平衡20 min；检测完成后，剩余试剂请及时置于4℃保存；
good◆gg3. 将 浓缩洗涤液(20×) 用双蒸水或去离子水稀释为1×洗涤液；
good◆gg4. 将 标准品稀释液(5×) 用双蒸水或去离子水稀释为1×标准品稀释液；
good◆gg5. 按标准品标签上注明的复溶体积，用1×标准品稀释液复溶使标准品终浓度达到200 pg/mL，室温操作，请严格控制在25~28℃，静置15~20 min后轻轻混悬，用移液器吹打数次，使其彻底溶解，然后按下表用1×标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。(最高浓度为200 pg/mL，将1×标准品稀释液作为浓度0 pg/mL。)
| 管号 | 稀释液用量(μL) | 复溶后标准品用量(μL) | 标准品的最终浓度(pg/mL) |
| A | 0 | 250 | 200 |
| B | 250 | 250 | 100 |
| C | 250 | 250(从B管中取) | 50 |
| D | 250 | 250(从C管中取) | 25 |
| E | 250 | 250(从D管中取) | 12.5 |
| F | 250 | 250(从E管中取) | 6.25 |
| G | 250 | 0 | 0 |
注意：标准品复溶加样后，剩余部分请丢弃。good◆ 检测流程
good◆gg6. 通过计算确定一次实验所需的板条数，取出所需板条放置于框架内，多余的板条请放回铝箔袋密封，保存于4℃；
注意：①标准品和样品建议做双复孔检测；
注意：② 建议设置本底较正孔，即空白孔，只加入相应体积的 显色剂TMB 和 终止液 即可；
注意：③ 每次实验均需绘制标准曲线。
good◆gg7. 将样品和不同浓度标准品(100μL/孔)分别加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，室温孵育120min。细胞上清样品一般可直接进行检测，如超过试剂盒的检测范围，可用1×标准品稀释液进行相应稀释；对于血清或血浆样品，需稀释100到1,000倍，如无明确范围，建议用1×标准品稀释液从200倍开始稀释，如果样品浓度过高，超过检测范围，请加大稀释倍数后重新检测；
注意：① 请查阅相关文献确定样品中待检测蛋白的大致浓度，若其大于或小于本试剂盒的最高或最低标准品浓度，请将样品适当稀释或浓缩后再进行检测；
注意：②整个加样过程不宜超过10 min，否则可能会影响检测结果。
good◆gg8. 洗板5次，每孔1×洗涤液用量为300μL，注入与吸出间隔15~30s，洗完后将板倒扣在厚吸水纸上拍干；
注意：洗涤过程至关重要，洗涤不充分会导致结果产生较大误差。
good◆gg9. 加入人铁调素生物素化抗体(100μL/孔，无需稀释)。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育60min；
注意：检测血清和血浆样品时，检测抗体的孵育时间应适当延长。
good◆gg10. 洗板5次，方法同步骤8；
good◆gg11. 加入HRP标记的亲和素(100μL/孔，无需稀释)。用封板胶纸封住反应孔，避光室温孵育20min；
good◆gg12. 洗板5次，方法同步骤8；
good◆gg13. 加入显色剂TMB(100μL/孔)，避光室温孵育10~20min；
注意：在保存和使用时，请勿将TMB接触氧化剂和金属。
good◆gg14. 加入终止液(50μL/孔)，混匀后即刻使用酶标仪测量OD450，同时设定540nm或570nm作为校正波长，即可计算得到校正吸光度值(OD450－OD540或OD450－OD570)；
注意：读取OD值建议在10 min内完成。good◆ 数据分析
good◆gg15. 绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，利用计算机软件作四参数逻辑(4-PL)曲线拟合创建标准曲线，通过样品的OD值即可在标准曲线上计算出其相应浓度。
注意：①复孔OD值在20%的差异范围内结果才有效，复孔OD值取平均后可作为测量值；
注意：② 每个标准品或样品的OD值应减去本底校正孔的OD值；
注意：③ 若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。good◆ 标准曲线范例
人铁调素(Hepcidin)参考标准曲线
注意：本图仅供参考，应以同次试验标准品所绘标准曲线计算样品含量。
注意事项good1. 浓缩洗涤液低温情况下可能会出现结晶，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液；
good2. 严禁混用不同批号试剂盒的组分；
good3. 加样过程请避免产生气泡，实验操作过程中一定要保证试剂充分混匀，否则会使结果产生较大误差；
good4. 说明书中提到的室温条件，请严格控制在25~28℃；
good5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作；
good6. 本产品仅限科研使用。
