服务优势：
（1）优化升级的过表达载体，更优质的表达效果
（2）快速交付，项目周期快至八周
（3）具备丰富细胞培养经验
服务内容：
（1）项目评估
（2）细胞抗生素敏感浓度摸索与单克隆形成验证
（3）过表达载体构建
（4）慢病毒包装与转染
（5）阳性多克隆筛选
（6）阳性单克隆筛选
（7）蛋白免疫印迹实验（ WB ）
服务周期：根据细胞生长特性与基因不同，服务周期在8～16周不等
客户提供：靶细胞及其培养方案、基因名称
服务流程：

交付标准：1×基因过表达阳性多克隆/单克隆细胞株（复苏）
1×项目结题报告
服务保证：
（1）项目启动后，密切跟进实验进展，每两周进行一次项目进度汇报。
（2）项目结题报告包含实验详细记录等，满足客户后期论证材料需求。
（3）基因过表达阳性多/单克隆均经过蛋白免疫印迹实验验证，保证蛋白表达效果。

【案例分享】基因过表达细胞株构建

1 过表达载体构建
利用同源重组的方法构建LentiCRISPRv2-GOI过表达载体，采用双酶切的方式获得线性化载体，根据同源重组设计目的片段的引物。目的片段的获得分为两步PCR方法，第一步从模板中扩增出目的片段的ORF，第二步扩增加入Gsg-3×FLAG序列。采用one step cloning试剂盒连接目的片段与线性化载体，利用Amp进行抗性筛选。
1、基因序列扩增（图1）

图1 基因序列第一轮扩增
2、基因序列扩增，添加标签及同源序列
3、双酶切pLentiCRISPRv2载体

图2 目的基因第二轮PCR及线性化载体纯化结果。
4、目的基因与线性化载体连接
利用ClonExpress II one step coloning Kit连接目的片段和线性化载体。每个实验组各挑取单克隆菌落，于LB/ Amp培养基中扩增，并送样测序。
5、LentiCRISPRv2-GOI无内毒素质粒提取
2 病毒包装
1、培养细胞，配制PEI-Opti-MEM和质粒混合液，将PEI-Opti-MEM加入各质粒混合液中，轻弹管壁混匀，室温静置孵育15～20 min。
2、将上混合液小心滴加到培养基中，轻轻晃动摇匀，在培养箱中继续培养18 h。
3、18 h后小心吸去培养基，加入5 mL新配制的完全培养基。
4、42 h后收集培养上清，离心，0.45µm滤膜过滤，液氮速冻，-80℃保存。
3 细胞转染
1、配制梯度病毒稀释液
2、在六孔板中加入病毒稀释液，随后立即加入细胞，摇匀，以下每孔依次按此操作进行。细胞于培养箱中静置培养48 h。
4 阳性多克隆细胞株筛选
5 阳性单克隆细胞株筛选
1、细胞转染48 h后，更换完全培养基，随后1～2 d更换一次。
2、筛选7天后，对照组细胞全部死亡，实验组细胞扩大培养，同时进行单克隆细胞筛选。
3、96孔板每孔加100 μL细胞悬液，用封口胶将孔板封好，放于培养箱中培养
静置培养48 h后，更换完全培养基，随后1～2 d更换一次，每日观察并记录单克隆形成情况。
6 阳性单克隆细胞株验证
1、测序验证
提取单克隆细胞株基因组DNA，测序验证基因稳定转染单克隆细胞株的基因序列的准确性
2、Western blot

图3 阳性单克隆细胞株基因表达验证——Western blot