大鼠单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)酶联免疫吸附测定试剂盒
Rat MCP-1 ELISA Kit
本产品冰袋运输；保存于4℃(其中 标准品 需保存于-20℃)，保质期6个月；标准品如存放于4℃，1~2周内有效。
货号规格
HJ14496次
产品特点g
d高灵敏度——多次重复结果表明，最小检出量为8.9 pg/mL；gd高特异性——与大鼠CCL3/MIP-1α、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1α、IL-1β等均无交叉反应，与小鼠MCP-1有33%交叉反应性；gd重复性好——板内，板间变异系数均小于10%。
产品简介
good本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样品中大鼠单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的浓度。大鼠MCP-1捕获抗体已经预包被于酶标板上，当加入样品或标准品时，其中的大鼠MCP-1会与捕获抗体结合，而其它游离成分则会通过洗涤被除去。接着，再加入生物素化的抗大鼠MCP-1抗体后，抗大鼠MCP-1抗体与大鼠MCP-1接合，形成夹心的免疫复合物，其它游离成分则通过洗涤被除去。随后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲合素，生物素与亲合素特异性结合，这样亲合素上标记的HRP就与夹心的免疫复合物连接起来，而其它游离成分则通过洗涤被除去。最后加入显色剂，若样品中存在MCP-1，则会形成免疫复合物，其上连接的HRP会催化无色的显色剂氧化生成蓝色物质，而后加入终止液，最终产物呈黄色。通过酶标仪检测，读其450 nm处的OD值，大鼠MCP-1浓度与OD450值之间呈正比，通过标准品绘制标准曲线，对照未知样品中OD值，即可计算出样品中大鼠MCP-1浓度。
背景简介
good单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1/CCL2)又被称为单核细胞趋化与激活因子(MCAF)，是趋化因子家族CC亚族的一员。大鼠MCP-1 cDNA编码99个氨基酸组成的前体蛋白，然后经酶切除疏水性信号肽(23个氨基酸)，最终成为只具有76个氨基酸的成熟蛋白。
good在机体发生炎症时,单核细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、B细胞以及平滑肌细胞等均能分泌产生MCP-1，且MCP-1对单核/巨噬细胞具有特异性趋化激活作用，尤其在类风湿性关节炎、肾小球肾炎、动脉粥样硬化、急性冠状动脉综合征以及深静脉血栓等疾病的发生和发展过程中扮演着重要角色。
产品内容| 组分 | 体积或数量 |
| 大鼠MCP-1预包被板 | 12条 |
| 样品分析缓冲液 | 5mL |
| 标准品稀释液(5×) | 10mL |
| 大鼠MCP-1标准品 | ≥2支(冻干) |
| 大鼠MCP-1生物素化抗体 | 10mL |
| HRP标记的亲和素 | 10mL |
| 浓缩洗涤液(20×) | 30mL |
| 显色剂TMB | 10mL |
| 终止液 | 5mL |
| 封板胶纸 | 3张 |
操作步骤good◆ 样品制备
good◆gg1. 根据样品种类选择相应的处理方法：
good◆ 样1. 根A. 细胞上清：将细胞培养上清液100~500×g离心5min，去除悬浮物后即可；
good◆ 样1. 根B. 血清样品：将全血在室温下静置0.5~2 h，待其自然凝固并析出血清后，离心取黄色上清即可(4℃，1000~2000×g，10min)，注意请勿吸取沉淀，制备好的血清需置于冰上待用，请勿在其中添加任何防腐剂或抗凝剂；
good◆ 样1. 根C. 血浆样品：使用EDTA对全血进行抗凝处理后，混合均匀置于冰上，离心取黄色上清即可(4℃，1000~2000×g，10min)，注意请勿吸取沉淀，制备好的血浆需置于冰上待用；
注意：①大鼠血清或血浆样品请用样品分析缓冲液做倍比稀释后再检测；
注意：②若待测样品无法及时检测，样品制备完成后，请分装冻存于-20℃，避免反复冻融；
注意：③ 请保证待测样品清澈透明，检测前如发现样品中有悬浮物，需通过离心去除；
注意：④ 为了保证检测结果准确，请勿使用溶血、黄疸、高血脂或污染的样品。good◆ 检测准备工作
good◆gg2. 试剂盒自冰箱取出后，请置于室温平衡20min；检测完成后，剩余试剂请及时置于4℃保存；
good◆gg3. 将浓缩洗涤液(20×)用双蒸水或去离子水稀释为1×洗涤液；
good◆gg4. 将标准品稀释液(5×)用双蒸水或去离子水稀释为1×标准品稀释液；
good◆gg5. 按标准品标签上注明的复溶体积，用1×标准品稀释液复溶使标准品终浓度达到1,000 pg/mL，室温操作，请严格控制在25~28℃，静置15~20min后轻轻混悬，用移液器吸打数次，使其彻底溶解，然后按下表用1×标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。(最高浓度为1,000 pg/mL，将1×标准品稀释液作为浓度0 pg/mL。)
| 管号 | 稀释液用量(μL) | 复溶后标准品用量(μL) | 标准品的最终浓度(pg/mL) |
| A | 0 | 250 | 1,000 |
| B | 250 | 250 | 500 |
| C | 250 | 250(从B管中取) | 250 |
| D | 250 | 250(从C管中取) | 125 |
| E | 250 | 250(从D管中取) | 62.5 |
| F | 250 | 250(从E管中取) | 31.25 |
| G | 250 | 0 | 0 |
注意：标准品复溶加样后，剩余部份请丢弃。good◆ 检测流程
good◆gg6. 通过计算确定一次实验所需的板条数，取出所需板条放置于框架内，多余的板条请放回铝箔袋密封，保存于4℃；
注意：①标准品和样品建议做双复孔检测；
注意：② 建议设置本底较正孔，即空白孔，只加入相应体积的 显色剂TMB 和 终止液 即可；
注意：③ 每次实验均需绘制标准曲线。
good◆gg7. 将样品和不同浓度标准品(100μL/孔)分别加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，室温孵育120min。细胞上清样品一般可直接进行检测，如超过试剂盒的检测范围，可用1×标准品稀释液进行相应稀释；对于血清或血浆样品，可先在孔中加入50μL样品分析缓冲液，接着加入50μL样品，如超出检测范围，可先加入50μL样品分析缓冲液，接着加入50μL用1×标准品稀释液稀释后的样品，再进行检测，请注意记录好样品的稀释倍数；
注意：① 请查阅相关文献确定样品中待检测蛋白的大致浓度，若其大于或小于本试剂盒的最高或最低标准品浓度，请将样品适当稀释或浓缩后再进行检测；
注意：②整个加样过程不宜超过10 min，否则可能会影响检测结果。
good◆gg8. 洗板5次，每孔1×洗涤液用量为300μL，注入与吸出间隔15~30s，洗完后将板倒扣在厚吸水纸上拍干；
注意：洗涤过程至关重要，洗涤不充分会导致结果产生较大误差。
good◆gg9. 加入大鼠MCP-1生物素化抗体(100μL/孔，无需稀释)。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育60min；
注意：检测血清和血浆样品时，检测抗体的孵育时间应适当延长。
good◆gg10. 洗板5次，方法同步骤8；
good◆gg11. 加入HRP标记的亲和素(100μL/孔，无需稀释)。用封板胶纸封住反应孔，避光室温孵育20min；
good◆gg12. 洗板5次，方法同步骤8；
good◆gg13. 加入显色剂TMB(100μL/孔)，避光室温孵育10~20min；
注意：在保存和使用时，请勿将TMB接触氧化剂和金属。
good◆gg14. 加入终止液(50μL/孔)，混匀后即刻使用酶标仪测量OD450，同时设定540nm或570nm作为校正波长，即可计算得到校正吸光度值(OD450－OD540或OD450－OD570)；
注意：读取OD值建议在10 min内完成。good◆ 数据分析
good◆gg15. 绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，利用计算机软件作四参数逻辑(4-PL)曲线拟合创建标准曲线，通过样品的OD值即可在标准曲线上计算出其相应浓度。
注意：①复孔OD值在20%的差异范围内结果才有效，复孔OD值取平均后可作为测量值；
注意：② 每个标准品或样品的OD值应减去本底校正孔的OD值；
注意：③ 若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。good◆ 标准曲线范例
大鼠单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)参考标准曲线
注意：本图仅供参考，应以同次试验标准品所绘标准曲线计算样品含量。
注意事项good1. 浓缩洗涤液低温情况下可能会出现结晶，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液；
good2. 严禁混用不同批号试剂盒的组分；
good3. 加样过程请避免产生气泡，实验操作过程中一定要保证试剂充分混匀，否则会使结果产生较大误差；
good4. 说明书中提到的室温条件，请严格控制在25~28℃；
good5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作；
good6. 本产品仅限科研使用。
