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牡蛎疱疹病毒 1 型探针法荧光定量PCR 试剂盒

￥1
YLKBIO
国产
2022-09-06 11:32
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优利科（上海）生命科学有限公司

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优利科（上海）生命科学有限公司
王经理
产品属性
产品说明
牡蛎疱疹病毒 1 型探针法荧光定量PCR 试剂盒

产品及特点
牡蛎疱疹病毒(Ostreid herpesvirus-1，OsHV-1)是引起多种双壳贝类特别是牡蛎大规模死亡的致死性病毒，在世界范围内广泛流行，主要危害牡蛎、扇贝、 菲律宾蛤仔及魁蚶等种类，对贝类养殖业造成重大的损害。本产品就是以探针法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测牡蛎疱疹病毒 1 型的试剂盒，它具有下列特点：
  1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。
  2. 引物和探针经过优化，灵敏性高。
  3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
  4. 特异性高，引物是根据牡蛎疱疹病毒 1 型高度保守区设计，不会跟其他病原DNA 发生交叉反应。
  5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。
  6. 本产品只能用于科研。
运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。

自备试剂

样品 DNA。


使用方法

一、稀释标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。1. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
  1. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
  2. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
  3. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
  4. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
  5. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。样品 DNA 的制备
  6. 如果有 N 个样品，最好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 阳性对照的 10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为 NC。
  7. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼容。

    Probe qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）

  8. 如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），6 个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 PCR 阳性对照（用第 4 号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
  9. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设 置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好 后最后加）
  10. 成分样品管
    N+2 个    		PCR 阴
    性对照管    		标准曲线
    样品管（2-7 管）
    2×Probe qPCR MagicMix10 μL10 μL各 10 μL
    牡蛎疱疹病毒 1 型 qPCR 探针1 μL1 μL各 1 μL
    牡蛎疱疹病毒 1 型探针法 qPCR
    引物混合液    		2 μL2 μL各 2 μL
    N+2 个待测 DNA 模板7 μL--
    超纯水-7 μL-
    第 7 步所得标准曲线样品稀释液
    （2-7 号）
    -
    -    		各 7 μL（2 号样到 2 号管，3 号样到 3
    号管…）


  1. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR：

    过程 温度 时间

    预变性95℃3 min
    PCR 反应
    （40 个循环）    		95℃15sec
    60℃1 min（采集 FAM 通道的荧光
    信号）


四、数据处理
  1. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品RNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。
  2. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。若重复结果 Ct 值
小于 40，扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。




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