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siRNA/shRNA/miRNA/DNA转染细胞实验

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最新更新日期：2021-06-10 08:49

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提供商	上海经科化学科技有限公司

服务名称	siRNA/shRNA/miRNA/DNA转染细胞实验

规格

批

产品说明

siRNA/shRNA/miRNA/DNA转染细胞实验服务

一、实验简介
细胞转染是指将外源分子如DNA、RNA等导入真核细胞的技术。主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、病毒介导的转染等，理想的转染方法是具有高转染效率、对细胞毒性作用小等。其中脂质体转染是常用的简便转染方法。
脂质体（liposome）转染方法的原理在于，阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹，形成DNA-脂复合体，被表面带负电荷的细胞膜吸附。再通过膜的融合或细胞的内吞作用，偶尔通过直接渗透作用，将DNA转运至细胞内，形成包涵体或进入溶酶体。当DNA从包涵体内释放后，进入细胞质，再进一步进入核内实现转录、表达。
细胞感染是指通过病毒载体将外源分子导入真核细胞。因病毒可以通过自身的侵袭作用进入宿主细胞后，可以利用细胞中的物质和能量以及复制、转录和转译的能力，按照自身核酸所包含的遗传信息产生和它一样的新一代病毒。利用这种特性，去掉病毒的致毒基因并将外源基因片段插入制成病毒载体，进而将目的片段转入受体细胞，使目的基因可以表达，甚至将基因遗传给后代稳定的表达。目前常见用于转染的病毒有，慢病毒，逆转录病毒，腺病毒等。
二、siRNA/shRNA/miRNA/DNA转染细胞实验步骤（以6孔板为例）
1 转染前一天接种细胞于6孔板，5×10⁴每孔，第二天转染时细胞汇合度达到60%-70%每孔。
2 转染前半小时将完全培养基换无血清培养基1.9 ml。
3 A液：RNA 100pmol/DNA 2μg（根据核酸类型不同，用量不同）加入50 ul Opti-MEM无血清培养基，轻轻混匀，室温静置5min。
4 B液：脂质体使用前轻轻混匀，脂质体5ul 加入50 ul Opti-MEM无血清培养基，轻轻混匀，室温静置5min。
5 B液加入到A液中，用枪轻轻混匀，室温静止20min。
6 将混合液均匀分散慢慢滴加到6孔板细胞中，边滴加边前后左右十字交叉轻轻摇晃。
7 孵箱37℃培养4~6h，然后将无血清培养基换成完全培养基继续培养。
8 mRNA 水平的检测：在转染后24-48h后，用Real-time PCR的方法在mRNA水平进行检测。
9 蛋白水平的检测：在转染后48-72h后，用Western-blot或免疫组化的方法在蛋白水平进行检测。
三、细胞感染实验步骤（以慢病毒感染为例）
1、转染前一天，取2-3×10⁵cells/well的细胞接种在6孔板上，培养24h后将原有培养基弃去，加入2mL的细胞完全培养基。
2、置于CO₂浓度为5%的培养箱中于37℃培养至细胞汇合达到40-60%。
3、细胞换液，将病毒液与终浓度5μg/ml polybrene加入新鲜培养基中。8-12h后观察细胞状态，若细胞状态无明显病变，继续培养，24h后更换新鲜培养基。
4、根据公式计算病毒用量（细胞数×MOI值/病毒原液滴度）×10³=病毒用量（μl）
5、72-96h察荧光表达情况，对生长代谢缓慢的细胞，可适当延长观察时间，并及时换液和传代维持细胞生长状态。

注意：感染细胞最佳MOI的测定：MOI（感染复数）是指每个细胞感染的病毒数。通常MOI高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。对于分裂活跃的细胞，例如HeLa、293细胞，MOI=1-3时，80%以上细胞均表达目的基因。而对于非活跃的细胞，如原代细胞，感染效率较低，需要进行MOI浓度摸索实验，选择合适的MOI后再进行后续实验。

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