HS 683（人脑胶质瘤细胞）实验，每一个步骤都要无菌操作。从开始的准备工作，枪头，EP管，PBS等的高压；做实验前紫外灯的照射，实验人员佩戴口罩帽子穿超净隔离服；所用试剂如果是很多人一起用，最好分装，培养基最多一次配制一百到二百毫升，以免污染后浪费。不放心试剂的可以用小的培养皿验菌。剩下的就是操作的规范性了，如果是刚开始做，在进细胞间前应该自己先把步骤捋一遍，保证心中有数，不会手忙脚乱。操作时注意细节，比如枪头是否碰到不干净的区域，立即换枪头。不同细胞还要注意互相之间不能交叉的。

  细胞名称HS 683（人脑胶质瘤细胞）

  种属人

  年龄（性别）男；76岁

  组织来源

  生长特性贴壁

  细胞形态成纤维细胞样

  背景描述HS 683细胞源自76岁白人男性的左颞叶侧胶质瘤组织；HS 683细胞有微绒毛，无桥粒。

  生长培养基DMEM高糖＋10%FBS＋1%P/S

  培养条件气相：空气，95%；CO2，5%温度：37℃

  HS 683（人脑胶质瘤细胞）分别针对两种运输方式来谈下对新细胞的处理过程：

  对于直接寄送冻存细胞的情况，首先要检查的就是细胞收到后是否有足量剩余干冰，如果干冰不足，或是已经没有干冰，则细胞状态可能会收到影响，建议尽快复苏；如果有足量干冰，建议先转移至-80℃冰箱过夜，于第二天按正常流程复苏，即37℃水浴锅中快速融解，低速离心后去除含DMSO的冻存液，换入适合细胞的新鲜培养基，轻柔吹匀后转移至培养皿中，补足培养基；一般贴壁细胞在24h内即可观察到细胞贴壁，从而判断细胞状态，悬浮细胞则复苏后即可观察细胞状态。对于冻存时间较长的细胞，可能需要传代1到2次后，细胞才会调整到正常状态，所以细胞复苏后如果状态不佳，不要灰心，仍要细心培养。

  对于复苏后寄送活细胞的情况，则细胞收到后要先检查细胞瓶是否有破损，细胞瓶在运输中很有可能受到碰撞和挤压，导致瓶体受损。如果发现细胞瓶受损，则需要尽快处理，该弃就弃。如果细胞瓶完好，则用酒精消毒瓶身，去除封口膜，然后置于37℃培养箱中静置1-2h。待细胞稳定后，观察细胞状态，并及时记录，因为很多国内细胞库都是可以反馈细胞状态的，如果收到时细胞状态不佳甚至污染，是可以要求重新寄送的。细胞如没有异常，则尽快传代并更换适合细胞的新鲜培养基。由于新细胞一般都是第一次接触，细胞传代过程中尤为需要注意胰酶消化时间，消化时间过短或过长都会影响细胞状态，甚至导致细胞死亡。我建议大家采用低浓度胰酶消化，消化时缩短放培养箱和观察的间隔时间，以便尽可能找到合适的消化时间。

  细胞培养步骤：

  1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

  2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

  1、对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：

  1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。

  2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。

  3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。

  4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6ml培养液的新皿中或者瓶中。

  PS：若客户收到2ml小管细胞，收到细胞后，用75%酒精喷洒整个管子消毒后放到超净台或安全柜内，严格无菌操作；将小管细胞转移至T25培养瓶或6cm培养皿，加入5ml左右完全培养基混匀，放入培养箱过夜培养后查看细胞密度：若密度未超过80%，换液继续培养，视情况传代或者冻存。若密度超过80%，可直接进行传代