核糖核蛋白复合物RNP
——CRISPR-Cas9基因编辑系统

北京泽平代理的进口IDT（Integrated DNA Technologies）Alt-R® CRISPR-Cas9基因编辑系统，提供免费序列设计工具，提供化学合成CRISPR-Cas9中crRNA（CRISPR-derived RNA）、sgRNA（small guide RNA）的定制合成服务，并生产通用型tracrRNA（trans-activating crRNA）、化脓性链球菌S. pyogene来源并由E.coli大肠杆菌表达的重组Cas9核酸酶（Cas9 nuclease，限制性内切酶，基因组DNA双链剪切）、重组Cas9切口酶（Cas9 nickase，即缺口酶，对靶链、或非靶链进行DNA单链剪切）、重组dCas9蛋白（无剪切功能，靶点占位蛋白，用于CRISPRi），用于形成核糖核蛋白复合物RNP，并提供增强RNP（ribonucleoprotein，核糖核蛋白复合体）电转染效率的电穿孔Enhancer试剂、增强HDR（Homology directed repair，同源重组修复）概率的HDR Enhancer试剂、HDR供体DNA的化学合成服务，提供从设计到多基因敲除、基因敲入、CRISPR干扰等全套试剂的基因编辑工具平台。

IDT Alt-R® CRISPR-Cas9概述

IDT的Alt-R® CRISPR-Cas9系统，分别对crRNA、tracrRNA、sgRNA序列进行优化缩短、化学修饰，对化脓性链球菌S. pyogene Cas9内切酶结构域进行突变，获得了高精确性的单链、双链剪切功能，再通过电穿孔（如Lonza Nucleofector核转染系统）转染RNP，可进行精确地基因编辑操作。

传统构建CRISPR-Cas9质粒的方法，质粒大小高达6-10kb，很难转染，而如使用原代细胞等难转染的细胞，转染效率更低。且质粒不断产生CRISPR-Cas9，使脱靶率显著增加。IDT转染RNP蛋白复合体的方法，通过优化CRISPR-Cas9组件，在提升剪切精确性的基础上，提高转染效率、减少细胞毒性、降低脱靶率，进而提高了基因编辑效率。












IDT Alt-R® CRISPR-Cas9产品

1、Alt-R® crRNA：由19-20nt特异性序列（定制）和16nt通用序列融合形成，相比野生型，序列更短，中靶率更高。经化学修饰防止被细胞核糖核酸酶降解，必须与tracrRNA一起使用以形成gRNA。

类型	产品名称	规格	包装
crRNA	Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA	2 nmol	管
		10 nmol	管
		2 nmol	板
		10 nmol	板
		50 nmol	管
		100 nmol	管

2、Alt-R® crRNA XT：相比Alt-R® crRNA，经其他化学修饰，用于高核酸酶条件或带有Cas9 mRNA的实验，可提高编辑的稳定性。必须与tracrRNA一起使用。

类型	产品名称	规格	包装
crRNA XT	Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA XT	2 nmol	管
		10 nmol	管
		2 nmol	板
		10 nmol	板

3、Alt-R® sgRNA：由crRNA和tracrRNA序列融合组成的单个RNA，含有19-20nt的特异性序列（定制）和80nt通用序列，经化学修饰，稳定性更高，用于高核酸酶条件或带有Cas9 mRNA的实验。相比体外转录的sgRNA，减少细胞免疫反应，更小细胞毒性。

类型	产品名称	规格
sgRNA	Alt-R® CRISPR-Cas9 sgRNA	2 nmol
		10 nmol
		50 nmol
		100 nmol
	Custom Alt-R® CRISPR sgRNA	定制

4、Alt-R® tracrRNA：通用67nt序列，远远短于野生型的89nt，缩短后性能提高，经化学修饰，具有核酸酶抗性。可提供荧光标记，检测转染效率。必须与crRNA一起使用以形成gRNA。

类型	产品名称	特点	规格	货号
tracrRNA	Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA	无标记	5 nmol	1072532
			20 nmol	1072533
			100 nmol	1072534
	Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA, ATTO 550	荧光标记	5 nmol	1075927
			20 nmol	1075928

图.稳定表达Cas9蛋白的HEK-293细胞，转染Alt-R® crRNA(未标记):tracrRNA(标记)，转染后48小时，荧光显微镜下10倍放大。








5、Alt-R® Cas9核酸酶：S. pyogene来源Cas9，大肠杆菌表达纯化，添加核定位序列（Nuclear localization sequence，NLS）和C端6-His标签。Alt-R® HiFi Cas9高保真核酸酶，经序列优化，提高中靶率，降低脱靶率。以10μg/μL的溶液提供。100μg Cas9核酸酶=610pmol。

类型	产品名称	规格	货号
cas9核酸酶	Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease V3	100 µg	1081058
		500 µg	1081059
	Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3	100 µg	1081060
		500 µg	1081061

6、Alt-R® Cas9切口酶：S. pyogene来源Cas9，大肠杆菌表达纯化，添加核定位序列NLS和C端6-His标签。其中Alt-R® Cas9 D10A切口酶中RuvC-like内切酶结构域功能失活，对DNA靶向链进行单链切割。Alt-R® Cas9 H840A切口酶，HNH结构域失活，对非靶向链单链切割。以10μg/μL的溶液提供。100μg Cas9切口酶=610pmol。

类型	产品名称	规格	货号
cas9切口酶	Alt-R® S.p. Cas9 D10A Nickase V3	100 µg	1081062
		500 ug	1081063
	Alt-R® S.p. Cas9 H840A Nickase V3	100 µg	1081064
		500 ug	1081065

7、Alt-R® dCas9蛋白：S. pyogene来源Cas9，大肠杆菌表达纯化，丧失内切酶功能，添加核定位序列NLS和C端6-His标签。dCas9蛋白可用于CRISPRi，进行基因下调（knockdown）等，相比RNAi，由于CRISPRi需要在转录起始位点附近才能发挥功能，其脱靶率远低于RNAi。Alt-R® dCas9蛋白，以10μg/μL的溶液提供。100μg dCas9蛋白=610pmol。

类型	产品名称	规格	货号
dCas9蛋白	Alt-R® S.p. dCas9 Protein V3	100 µg	1081066
		500 µg	1081067

8、Alt-R® Cas9电穿孔Enhancer：是Cas9特异性的载体DNA，当使用原代细胞或难转染细胞时，可提高Lonza(原Amaxa）Nucleofector核转染系统等电穿孔设备对RNP的转染效率，进而提高基因编辑效率。

类型	产品名称	规格	货号
电穿孔Enhancer	Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer	2 nmol	1075915
		10 nmol	1075916

9、Alt-R® HDR Enhancer：小分子化合物，可提高同源重组修复概率。在包括贴壁、悬浮的大量细胞系中均有活性，可用于Cas9核酸酶、Cas12a（Cpf1）核酸酶。

类型	产品名称	规格	货号
HDR Enhancer	Alt-R® HDR Enhancer	100 µL	1081072
		500 µL	1081073

10、Alt-R® HDR供体寡核苷酸：专门为同源重组修复基因敲入开发，具有比标准寡核苷酸更高的稳定性和更高的掺入率，可同时用于Cas9核酸酶和Cas9切口酶。










IDT Alt-R® CRISPR-Cas9实验流程

【方法一】
1、（使用IDT序列设计工具）设计Alt-R® crRNA，使其间隔区（Spacer）序列与DNA靶序列互补，提交给IDT定制合成crRNA；
2、将Alt-R® crRNA与Alt-R® tracrRNA混合，通过crRNA的重复序列区（Repeats）与tracrRNA碱基配对, 形成向导RNA（guide RNA，简称gRNA）；
3、将gRNA与Alt-R® Cas9蛋白混匀，形成核糖核蛋白体（ribonucleoprotein，简称RNP)；
4、将RNP通过电转染等导入细胞或细胞核；
5、通过crRNA的Spacer识别DNA靶序列，通过Cas9蛋白识别PAM序列（前间区序列邻近基序，protospacer adjacent motif，简称PAM），对DNA进行剪切；
6、对DNA断裂处进行修复
①进行非同源末端连接修复(Non-homologous end-joining，简称NHEJ），实现基因敲除（knockout）；
②（使用IDT序列设计工具）设计供体DNA模板，进行同源重组修复（Homology directed repair，简称HDR），实现基因敲入（knockoin）、基因敲除、基因沉默等。

【方法二】
1、（用IDT工具）设计sgRNA，使其Spacer与DNA靶序列互补，提交给IDT定制合成sgRNA；
2、将sgRNA与Cas9蛋白混匀，形成RNP；
3、将RNP通过电转染等导入细胞或细胞核；
4、通过sgRNA的Spacer识别DNA靶序列，通过Cas9蛋白识别PAM序列，对DNA进行剪切；
5、对DNA断裂处进行修复
①进行非同源末端连接修复，实现基因敲除；
②（用IDT工具）设计供体DNA模板，进行同源重组修复，实现基因敲入、敲除、沉默等。

IDT Alt-R® crRNA序列设计示意图














Alt-R® CRISPR-Cas9优势

1、特别优化的crRNA/tracrRNA/sgRNA长度，提高编辑性能



以HPRT基因中的12个位点为靶点，分别使用Alt-R® crRNA:tracrRNA、Alt-R® crRNA XT:tracrRNA、Alt-R® sgRNA，与Alt-R® Cas9核酸酶组装成3种RNP，加入2μM Alt-R® Cas9电穿孔Enhancer，转染HEK-293细胞，培养48小时后，通过二代测序检测总的编辑效率，结果显示其具有很好的稳定性。








2、化学修饰RNA，增加核酸酶抗性，减少免疫应答和细胞毒性


以HPRT1的12个位点为靶点，分别用Alt-R® crRNA:tracrRNA、体外转录（IVT）RNA，转染可高效表达化脓性链球菌Cas9蛋白的HEK-293细胞，24小时后，测定常见应激反应基因IFIT1（A）和OAS2（B）的表达水平。（A）qPCR显示IVT RNA强烈诱导IFIT1，而Alt-R® RNA无影响。（B）qPCR显示IVT RNA对OAS2的诱导可测，而Alt-R® RNA处于基线。同时IFITM1、RIGI、OAS1等3个应激反应相关基因均得到相似结果，说明Alt-R® RNA不会激活细胞先天免疫反应。







3、优化的Cas9蛋白和高保真HiFi Cas9蛋白，提供更高的特异性切割







4、电穿孔Enhancer，提高转染效率，尤其是原代细胞等较难转染的细胞

用0.125μM-4μM RNP（Alt-R® crRNA:tracrRNA:Cas9复合体），通过Lonza Nucleofector 核转染K562细胞（A）、Jurkat细胞（B）、HEK-293细胞（C）时，使用电穿孔Enhancer（深蓝色）、不使用（浅蓝色）的编辑效率。








5、HDR Enhancer，提高同源重组修复效率
①提高多种细胞HDR


以人HPRT为靶点，使用Lonza Nucleofector核转染系统，将4μM RNP（由Alt-R® crRNA、Alt-R® tracrRNA、Alt-R® Cas9组装），加入4μM Alt-R® Cas9电穿孔Enhancer，以3μM IDT Ultramer寡核苷酸作为同源重组修复DNA模板，转染人多种细胞系。电转后，细胞培养在含30μM Alt-R® HDR Enhancer的培养基中（绿色），或培养在含有DMSO的培养基中作为阴性对照（棕色），HEK-293、HeLa培养48小时，Jurkat、K562培养72小时，通过限制性片段长度多态性（RFLP）、靶序列PCR进行HDR分析，显示Alt-R® HDR Enhancer可提高多种细胞类型的同源重组修复效率。








②提高多种基因HDR


以人基因组多个位点为靶点，将4μM Alt-R® Cas9 RNP，加入4μM Alt-R® Cas9电穿孔Enhancer、3μM IDT Ultramer单链DNA模板，通过电穿孔转染。电转后，细胞分别培养在含30μM Alt-R® HDR Enhancer的培养基（蓝色）、含有DMSO的培养基（绿色）、未处理的培养基（棕色），48-72小时后，通过RFLP、PCR进行HDR分析，显示Alt-R® HDR Enhancer可提高不同基因的HDR效率。








6、在线CRISPR序列设计工具，方便地设计高质量的crRNA/sgRNA/同源重组修复DNA模板/引物等














如物种的基因组富含A、T，或Alt-R® CRISPR-Cas9的位点不适合，IDT同时提供CRISPR-Cas12a系统，尽可能满足编辑需求。

Cas9和Cas12a系统区别和应用

IDT Alt-R® CRISPR		Alt-R® CRISPR-Cas9系统					Alt-R® CRISPR-Cas12a（Cpf1）系统
		Alt-R® Cas9核酸酶	Alt-R® HiFi Cas9高保真核酸酶	Alt-R® Cas9 D10A切口酶	Alt-R® Cas9 H840A切口酶	Alt-R® dCas9蛋白	Alt-R® Cas12a核酸酶
特点		通用Cas9酶，易于使用且经济实惠	经序列优化的Cas9酶，提高中靶率，降低脱靶率，高性价比	突变的Cas9酶，在RuvC-like结构域中发生突变，使其缺失在非靶向链的切割能力	突变的Cas9酶，在HNH结构域中发生突变，使其缺失在靶向链的切割能力	突变的Cas9酶，仅结合靶向DNA，缺失核酸酶切割能力	通用Cas12a酶，富含AT的物种，或使用CRISPR-Cas9有限制
PAM识别		NGG					TTTV或TTTN
DNA切割		双链	双链	靶向链	非靶向链	\	双链
末端		平末端		5’突出	3’突出	\	5’突出
建议用途		一般基因编辑实验	满足大多数CRISPR基因编辑需求，兼顾效率和成本	适用于同时使用2种crRNA，各自识别并切割2条链中一条，通过将spacer由20nt提高到40nt，实现更高特异性		基因沉默，CRISPR干扰CRISPRi	无法使用Cas9的基因编辑实验
规格		100 μg或500 μg
Cas9 + gRNA	crRNA	19-20nt特异性序列（推荐使用20nt），16nt通用序列					\
	tracrRNA	67nt通用序列					\
Cas9 + sgRNA	sgRNA	19-20nt特异性序列（推荐使用20nt），80nt通用序列，经过序列修饰，不会引起细胞免疫反应，不会激活无关的基因					\
Cas12a + crRNA	crRNA	\					20-24nt特异性序列（推荐使用21nt），20nt通用序列

注：
N=任意碱基
V=A、C、G








参考文献

1. Large-scale GMP-compliant CRISPR-Cas9–mediated deletion of the glucocorticoid receptor in multivirus-specific T cells. Rafet Basar,et al.，Blood Advances (2020) 4 (14): 3357–3367
2. Partner independent fusion gene detection by multiplexed CRISPR-Cas9 enrichment and long read nanopore sequencing.Christina Stangl,et al.,Nature Communications volume 11, Article number: 2861 (2020)
3. sgRNA Sequence Motifs Blocking Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing. Robin Graf,et al.,Cell Reports,Volume 26, Issue 5, 29 January 2019, Pages 1098-1103.e3
4. Rapid in vitro production of single-stranded DNA. Dionis Minev,et al.，Nucleic Acids Research, Volume 47, Issue 22, 16 December 2019, Pages 11956–11962
5. Neuron-Specific Genome Modification in the Adult Rat Brain Using CRISPR-Cas9 Transgenic Rats.Susanne Bäck,et al.,Neuron,Volume 102, Issue 1, 3 April 2019, Pages 105-119.e8
6. Highly Efficient Transgenesis in Ferrets Using CRISPR/Cas9-Mediated Homology-Independent Insertion at the ROSA26 Locus.Miao Yu,et al.,Scientific Reports volume 9, Article number: 1971 (2019) 
7. RNA‐guided endonuclease – in situ labelling (RGEN‐ISL): a fast CRISPR/Cas9‐based method to label genomic sequences in various species.Takayoshi Ishii,et al., New Phytol. 2019 May; 222(3): 1652–1661.
8. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Christopher A. Vakulskas,et al.,Naturemedicine,Published: 06 August 2018
9. Increasing Cas9-mediated homology-directed repair efficiency through covalent tethering of DNA repair template. Eric J. Aird,et al.,Communications biology, Published: 31 May 2018



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