1.microRNA靶点的预测
利用Targetscan,miRanda,Microcosm,Pita等软件得到目的microRNA的预测靶点序列(客户提供或由我公司预测)。
2.获得microRNA靶点序列
根据提供的靶序列，合成两条互补的单链DNA模板。或者，设计引物PCR扩增目的microRNA靶基因3’UTR序列。
3.microRNA靶序列克隆
将合成的两条单链退火成双链（具有粘性末端），或将PCR产物双酶切，后连入经过同样双酶切的psicheck报告基因载体中，连接产物转化大肠杆菌DH5α。
4.阳性克隆鉴定。
挑选转化的菌落，双酶切鉴定阳性克隆，并测序验证克隆的序列和目的microRNA靶序列一致。
5.细胞转染准备
将含目的microRNA靶基因的psicheck报告基因载体和microRNA mimics或microRNA negative control共转染293T或Hela细胞。
6.荧光素酶检测
共转染细胞24-72h后，进行双荧光素酶检测。
7.整理分析数据，得出结论。
提供有microRNA靶序列的报告质粒一份,甘油保存菌株各一支。附实验报告，包括载体构建过程，鉴定记录，测序报告，细胞转染，荧光检测。

在本公司做microRNA靶基因报告基因实验，可以享受a-f中一项免费生物信息学服务：

a)差异表达microRNA的筛选和聚类分析
b)microRNA靶基因预测
c)microRNA与靶标基因的调控网络构建
d)microRNA与编码蛋白基因共转录预测
e)microRNA与GO的调控网络构建
f)microRNA与KEGG Pathway的调控网络构建
g)microRNA甲基化位点预测
h)microRNA转录因子结合位点预测
i)microRNA与转录因子相互调控网络构建
j)转录因子与microRNA靶标基因调控网络构建
k)microRNA 、转录因子与靶标基因三者复杂调控网络构建