植物表达载体构建的全过程

载体构建转化：农杆菌的PCR鉴定采用文献［4］的方法分别提取农杆菌（EHA105，GV3101）中的miniTi质粒，【载体】用预先设计的引物进行PCR扩增鉴定，获得可用于遗传转化的农杆菌.【载体】

2结果

2.【载体】1PCR方法获取hIL12基因片段以质粒pCA13hIL12为模板，运用PCR方法获得全长hIL12基因（1613 bp，图2）.

2.2【载体】重组质粒pBI121hIL12的鉴定经限制性内切酶SmaI，SacI酶切后得到大小约1600 bp和12800 bp的大片段，表明hIL12已经克隆到质粒pBI121中（图3）. 质粒送上海生工生物工程公司进行全长测序鉴定，通过序列比对分析发现，目的基因与GenBank中已发表的基因序列完全一致，表明植物表达载体pBI121hIL12构建成功.

2.3【载体】转化农杆菌的PCR检测从三亲融合后的农杆菌中提取miniTi质粒，进行PCR扩增，扩增出大小约1600 bp的片段，与来自大肠杆菌DH5α中的重组质粒pBI121hIL12为模板的PCR产物一致，而对照空载根癌农杆菌单菌落为空白，表明获得了2种含hIL12基因的植物表达载体的农杆菌（图5）.

3讨论

hIL12是相对分子质量为75 ku的蛋白质，由不同基因编码的2个亚基P35与P40两条肽链通过二硫键结合在一起的异二聚体，研究表明，细胞必须同时表达这两个基因才能产生有活性的IL12. 我们选用的质粒pCA13hIL12中的hIL12基因就是利用这两个亚基具有独立的基因序列特点，将hIL12两个亚单位进行融合，中间插入一个Linker序列，以保证其基因产物具有正确的蛋白结构及等比例的表达.

实验中选用的载体pBI121是一个常用的植物表达载体，多克隆位点上游带有CaMV35S启动子，在植物组织中能启动外源基因的表达，下游带有GUS报告基因，由于酶切位点的要求，本实验的GUS已被切除，切除了GUS报告基因，给转化子的筛选带来了不便，但这一缺憾可以通过特异性引物进行PCR检测来弥补；在NOS启动子下游带有NPTII基因，可进行Kanamicin抗性筛选.

Mason等［5］提出了利用植物作生物反应器生产口服疫苗的设想. 我们构建的植物表达载体pBI121hIL12，可以用于马铃薯、烟草、番茄等植物的转化，从而为用植物作为生物反应器生产药用蛋白提供实验基础. 目前，将hIL12基因转入马铃薯的工作正在进行中. 我们成功构建了hIL12基因的植物表达载体，为最终实现用植物生产hIL12奠定了基础.

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