核酸分析

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2021-06-10 10:40

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张老师
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核酸分析

核酸分析技术一般包括核酸电泳、杂交技术、PCR技术、基因芯片。
1、核酸电泳
1DNA的凝胶电泳
凝胶电泳是分子克隆的中心技术之一。
1)琼脂糖凝胶用于分离大于2001000bp的片段;操作简单、快速,且分离范围广,分辨率高
2)聚丙烯酰胺凝胶用于分离5500bp的片段;效果好、分辨率极高,相差1bpDNA片断就能分开,能容纳相对大量的DNA用于核苷酸多态性的分析
2RNA的凝胶电泳
基本过程同DNA电泳一样,但应明确一点的是,因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感,因此必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶液,所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解;另外,因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结果,因此电泳时应在变性剂存在下进行,常用的变性剂为甲醛和戊二醛。
2、杂交技术
1Southern Blot
原理:将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后,通过琼脂糖凝胶电泳进行分离,继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上,固定后再与同位素或其它标记物标记的DNARNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列,则二者通过碱基互补的原理进行结合,游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测,从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途:检测样品中的DNA及其含量,了解基因的状态如是否有点突变、扩增重排等。
2Northern Blot
原理:在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳,继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。
用途:检测样品中是否含有基因的转录产物(mRNA)及其含量。
3)探针标记技术
1)标记物:放射性和非放射性两种:
放射性:32 P35 SH
非放射性:生物素、荧光素
2)标记方法:切口平移法、随机引物法、末端标记法、单链DNA探针标记、寡核苷酸探针标记法。
3PCR技术
PCR (Polymerase chain reaction) 是用一对寡聚DNA作为引物,通过加温变性-退火-DNA合成这一周期的多次循环,使目的DNA片段得到扩增。由于这种扩增产物是以指数形式积累的,经25-30个循环后,扩增倍数可达10 6
目的用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。
PCR技术的应用:基因检测、基因克隆化、DNA突变、DNA序列分析
4、基因芯片
利用核酸杂交的原理,应用于DNARNA的研究
基因芯片(Gene Chip)就是利用点样机等机械装置,在玻璃等支持物表面整齐地点上高密度的、成千上万个“点”,每个“点”含有可与一种基因杂交的一条DNA探针。由于芯片上有序地排列着DNA探针,因此也被称为微阵列(Microarray)。在芯片上滴加样品后,在合适的条件下,样品中含有的各种核酸片段(cDNAcRNA)就与相应的探针杂交。由于核酸片段上已标记有荧光素,激发后产生的荧光强度就与样品中所含有的相应核酸片段的量成正比,也就代表该基因的表达量。经激光共聚焦扫描仪等装置扫描后,所获得的信息经专用软件分析处理,即可获得成千上万种基因的表达情况。正因为这种特点,基因芯片技术已成为当前生命科学研究的热点之一。
基因芯片的应用:用于基因转录水平的检测、基因组分析和后基因组研究。