本试剂盒可以准确简便地进行mRNA的表达分析，采用的2×Maxima SYBR qPCR Mix为荧光实时定量PCR和Two-Step荧光实时定量PCR设计的最优反应体系，并结合特异性的细胞端粒酶催化亚基基因TERT引物，简化实验步骤和提高实验效率。Maxima SYBR qPCR Mix含有Maxima Hot Start Taq DNA聚合酶、dNTPS、进行优化处理的PCR反应缓冲液以及SYBR Green染料。使用Hot Start Taq DNA聚合酶，为PCR反应提供了更高的产量和灵敏度、特异性，能够检测低至10个拷贝的目的基因。

本试剂盒可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对细胞基因进行准确定量、检测，重复性好，可信度高。只需加入样品DNA模板，反应即可进行。

背景资料：

端粒是真核生物染色体末端特殊的DNA-蛋白结构，含多个重复序列(5'-TTAGGG-3')，端粒结构的形成和功能的维持需要端粒结合蛋白的直接或间接参与。端粒酶是细胞体内一种核糖核蛋白复合体，是由RNA和蛋白质亚基组成的一种特殊的逆转录酶，其可以利用自身的RNA模板合成末端DNA，并添加到染色体末端以克服末端序列的丢失，从而使细胞获得增殖能力。

端粒酶蛋白催化亚基(TERT或TRT)具有反转录酶的主要特征，其表达在正常细胞中受到抑制，研究表明，TERT或TRT的表达与端粒酶活性的表达一致，与端粒酶的活化程度密切相关。Wisman等在人卵巢癌中利用逆转录PCR检测hTERT的mRNA的表达，并采用TRAP法检测端粒酶活性，结果证实二者均存在于恶性肿瘤中并且表达模式相同。基于上述原理，百奥莱博实时荧光定量PCR端粒酶检测试剂盒通过检测TERT的mRNA表达水平来间接反应端粒酶的活性。

特别说明：

由于对端粒酶进行检测的所有方法都不能完全定量的检测细胞端粒酶的活性，同时TERT基因或者蛋白的表达与端粒酶之间的间接关系准确性有待于进一步研究，望客户根据实际选择使用。

产品组成：

组分	20T	50T
2×Maxima SYBR qPCR Mix	250μL	700μL
Nuclease-free Water	300μL	800μL
GAPDH-F Primer(1OD)	1支	1支
GAPDH-R Primer(1OD)	1支	1支
Human TERT-F primer(1OD)	1支	1支
Human TERT-R primer(1OD)	1支	1支

保存：-20℃，避光，有效期1年。

保存事项：
为确保引物的稳定性，本品以干粉的形式提供，规格为1OD。临用前，请将每支引物分别用25μL Nuclease-free Water或自备的DEPC水溶解成100μM的储液。然后根据实验需要，取适量100μM储液稀释成10μM的工作液，再取适量稀释后引物加入到反应体系中。100μM引物储液置于- 20℃至少保存6个月。

适用仪器：
适应于大多数的Real-time PCR扩增仪，包括Applied Biosystems，Eppendorf，Corbett，Bio-Rad，Roche，杭州博日(Line-GeneBioer)等品牌的PCR扩增仪。

注意事项：

1. 模板
   
   1. DNA：25μL的反应体系中的基因组以及质粒DNA浓度最多为500ng
      
   2. RNA：实时定量PCR体系中的RNA模板要求RNA模板没有基因组DNA的污染，我们建议使用DNase来消除痕量的基因组DNA的污染；在两步法实验体系中，最多5μg的总RNA用于cDNA的反转录合成，经反转录完毕后的cDNA模板总体系不应该超过实时定量PCR总体系的10%。
2. 必要的实验控制
   
   1. 阴性对照(NTC)：No template control反应是加入除模板DNA以外所有成分的阴性对照，可以避免或检测试剂中是否存在基因组DNA的污染、引物二聚体的产生。
      
   2. RT Minus阴性对照：Reverse Transcriptase Minus control反应是指加入除RT反转录酶制剂以外的全部组分，可以来检测RNA样本中是否含有基因组DNA的污染。

操作步骤：

1. 样本的处理：
   
   1. 提取样本RNA，并进行逆转录获得cDNA。
      注：百奥莱博可提供总RNA提取试剂(Trizol法，货号：KFS435)
      
   2. 将试剂盒中的组分溶解后，轻轻混匀并低速离心。
      
   3. 进行25μL体系的实时定量PCR请参考以下表格(DNA模板下一步中添加)：
      

      成分	用量
      2×Maxima SYBR qPCR Mix	12.5μL
      TERT Forward Primer(10μM)	0.8～1.0μM
      TERT Reverse Primer(10μM)	0.8～1.0μM
      Template DNA	﹤500ng
      Nuclease-free Water	至25μL

      注：
      ① 该体系中含有的MgCl₂终浓度为2.5mM
      ② 大多数体系中引物终浓度为0.3μM可得到好的实验结果，如有调整，建议引物终浓度范围在0.05～0.9μM。
      ③ 如果体系特殊要求，可以按照该体系进行调整。
      
   4. 将以上各组分(除DNA模板外)添加并混匀，加入至PCR反应管或反应板终。
      
   5. 添加DNA模板(≦500ng/反应)到第3步骤中准备好的PCR反应管或PCR板中。
      注：在两步法实时定量PCR中，加入的cDNA模板的体积不能超过反应总体积的10%
      
   6. 轻轻的混匀PCR管中的各组分，避免产生气泡，如需要，可进行低速离心。如果有气泡的存在会影响荧光强度的收集。
      
   7. 参照一下说明设置实时定量PCR循环仪，放入样品并启动程序。(如有需要，可以根据仪器本身特点进行调整)
2. 循环参数设置：
   循环反应可以采用三步法或两步法进行实验，参考数据如下：
   
   1. 三步法循环参数设置：
      

      阶段	温度	时间	循环数
      (可选)UDG预处理	50	2min	1
      总变性	95℃	10min	1
      变性	95℃	15s	40
      复性	60℃	30s
      延伸	72℃	30s

      注：荧光信号的收集和处理是在延伸阶段
      
   2. 两步法循环参数设置
      

      阶段	温度	时间	循环数
      (可选)UDG预处理	50	2min	1
      总变性	95℃	10min	1
      变性	95℃	15s	40
      复性/延伸	60℃	60s

      注：荧光信号的收集和处理是在延伸阶段
3. 可选步骤：
   
   1. UDG预处理：如需减少PCR产物的污染，可以于总变性前用UDG预处理2min。
      
   2. 熔解曲线分析：可用于验证引物设计的特异性以及鉴定PCR产物。如果引物设计不够优化，可能会产生部分的引物二聚体，这些引物二聚体可以通过熔解曲线观测到。
4. 备注：
   
   1. 建议采用25μL的实验体系，如果改变请参照其余说明进行调整。
      
   2. 主反应混合液Master mix含有除模板、引物外的全部组分，避免其反复冻融和污染是进行一个成功实时定量PCR反应的重要步骤。
      
   3. PCR扩增仪设定时需要建立起始10分钟、95℃的变性程序以激活Maxima Hot Start DNA聚合酶。
      
   4. 一般实时定量实验中采用适宜体系确保2×Maxima SYBR qPCR Mix的最小化，避免产生大量的荧光强度。
      
   5. 针对不同实验条件和仪器型号重新调整荧光阈值。
      
   6. 当使用Bio-Rad的iCycler iQ或MyiQ system时请按照仪器生产商的说明进行实验。

问题分析：

问题	可能原因以及解决方案
没有扩增曲线，琼脂糖电泳检测不到PCR产物	体系中混入了PCR反应的抑制剂 重新纯化或提取基因组DNA 引物发生降解 对引物降解进行分析 实时荧光定量PCR中加入的逆转录产物过量 实时荧光定量PCR中加入的逆转录反应产物的体积不要超过总反应体积的10% 加样错误或者没有添加某一组分 重新进行实验，确认添加模板或引物的浓度； 确认试剂存放的温度条件，注意加样完全。 引物的降解 可以采用聚丙烯酰胺电泳对引物进行验证，如有问题重新合成引物。 复性温度不合理 优化复性温度，可以采用常规PCR进行摸索和分析 UDG预处理的条件下，复性温度过低 进过UDG处理后，PCR反应的复性温度应该高于55℃，如果复性温度必须要低于55℃，建议采用Heat-labile UDG
没有获得扩增曲线	实时荧光定量PCR仪器设置错误 检测仪器检测参数是否正确(荧光染料的选择，荧光检测参数的设置等) 没有激活荧光检测装置 激活荧光检测装置，设置于复性/延伸阶段或者延伸阶段收集荧光信号 PCR仪器错误 参考仪器说明书解决仪器问题
无模板阴性对照获得扩增荧光信号	试剂中存在DNA污染 参考常规消除DNA污染的方法对模板进行处理 更换新的PCR试剂 RNA样本中存在基因组DNA的污染 设计含有内含子的扩增引物 对污染的RNA样本使用DNase处理，确保反转录实验没有DNA的污染
PCR效率超过110%	非特异性产物 使用熔解曲线对PCR产物分析，鉴定PCR产物的特异性； 纯化DNA模板。
PCR效率低于90%	体系中存在PCR抑制剂 重新纯化DNA模板 PCR反应条件不合适 确认试剂的存放条件，确认引物浓度
标准曲线不佳	DNA模板的浓度过大 建议25μL的反应体系中DNA的最大量为500ng 模板质量较差 如果可能，提高DNA模板的质量 添加的逆转录反应产物过量导致抑制作用 实时定量PCR中加入的逆转录反应产物的体积不要超过总反应体积的10%。
荧光强度不一致(重复性较差)	实时荧光定量PCR循环仪存在污染 根据仪器厂商说明清理仪器，减少影响实验的污染因素 PCR循环仪校准较差 根据仪器厂商说明调整仪器